社区获得性肺炎中肺炎克雷伯菌耐药性及产AmpC酶基因菌株的检测*

魏娟娟， 史晓艳

(1.榆林市中医院 检验科， 陕西 榆林 719000； 2.榆林市星元医院 检验科， 陕西 榆林 719000)

社区获得性肺炎中肺炎克雷伯菌耐药性及产AmpC酶基因菌株的检测*

魏娟娟1*， 史晓艳2

(1.榆林市中医院 检验科， 陕西 榆林 719000； 2.榆林市星元医院 检验科， 陕西 榆林 719000)

目的： 探讨社区获得性肺炎(CAP)患者肺炎克雷伯菌耐药性及产β-内酰胺(AmpC)酶情况。方法： CAP患者72例，吸取痰液进行肺炎克雷伯菌培养筛选分离，采用K-B法检测肺炎克雷伯菌对8种抗菌药物的耐药性，聚合酶链式反应( PCR)检测肺炎克雷伯菌中AmpC酶基因的表达。结果： 72例患者共检出100株细菌，肺炎克雷伯菌30株(30%)；肺炎克雷伯菌对亚胺培南无耐药性，对头孢吡肟、阿米卡星的耐药率较低，而对青霉素类和第2、3代头孢类药物耐药率较高；在30株肺炎克雷伯菌中，检出AmpC阳性表达菌株11株(36.7%)。结论： 肺炎克雷伯菌对青霉素类和第2、3代头孢类药物耐药，产AmpC酶基因检出率较高。

社区获得性肺炎； 克雷伯菌，肺炎； β-内酰胺酶类； 耐药性

社区获得性肺炎(community acquired pneumonia, CAP)是指在医院外、社区中罹患的感染性肺实质炎症[1]。由于临床抗菌药物的广泛应用，细菌的耐药性也逐渐增强，已成为抗感染治疗中的最大问题，也导致了CAP有较高发病率和病死率，严重影响患者的身心健康[2]。β-内酰胺类抗生素制剂是目前使用最普遍的治疗细菌性社区获得性感染的药物[3]，其中AmpC β-内酰胺酶(AmpC β-lactamases，AmpC酶)是主要β-内酰胺酶之一，能够介导革兰阴性杆菌对新型广谱β内酰胺类抗生素耐药[4-5]。高产AmpC酶菌株占CAP感染菌株的30%左右，高产AmpC酶细菌使临床抗感染治疗更加困难[6]。肺炎克雷伯菌是主要的高产AmpC酶菌株[7]。本文探讨CAP中肺炎克雷伯菌检出情况、耐药性及产AmpC酶情况，为临床提供参考，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选择2011年7月～2013年12月收治的CAP患者72例，男40例，女32例；年龄39～79岁，平均(64.31±2.19)岁；病程1月～4年，平均(1.72±0.78)年；平均体质指数(BMI)为(24.35±2.87)kg/m2。病例纳入标准：符合CAP的诊断标准，年龄<80岁，知情同意。排除有严重的全身疾病、糖尿病及痰液涂片质量不合格者。

1.2 菌株鉴定及药敏试验

CAP患者在使用抗生素前先用无菌生理盐水清洁口腔(无痰或者痰少患者用3%高渗盐水雾化诱导痰液)，用负压吸引器一次性吸痰管吸取咽部以下痰液进行细菌培养[2]，培养24 h后，挑取培养基中可疑为病原菌的单菌落，采用法国生物梅里埃API手工鉴定卡鉴定肺炎克雷伯菌菌株。取已经鉴定的肺炎克雷伯菌菌株于5% CO2、37 ℃的培养箱中培养24 h，挑取单菌落细菌进行药敏试验，药敏试验按照美国临床实验室国家标准化委员会(NCCLS)2012的标准， K-B法检测肺炎克雷伯菌对头孢吡肟、阿米卡星、亚胺培南、氨苄西林、头孢呋辛、头孢唑啉、环丙沙星、庆大霉素的耐药性，质控菌株为标准的克雷伯菌 (编号201134922)。药敏纸片由英国OXOID公司提供，抗菌素均为购自中国药品生物制品检定所的标准药物，纯度都为99.99%以上，都处于有效期内。

1.3 AmpC酶基因检测

聚合酶链式反应( PCR)检测肺炎克雷伯菌中AmpC酶基因的表达，3 000 r/min离心收集肺炎克雷伯菌，采用酚氯仿法提取细菌DNA，紫外分光光度法鉴定DNA的浓度和纯度。根据Amp基因的保守序列，采用引物设计软件primer 5设计扩增引物，正向引物序列为5′TGA TGG CAC AGC AGG ATA3′，反向引物序列为5′GGCTTTGACTCTTTCGGTA3′。 片段大小为445 bp，反应体系为模板DNA 50 ng ，10×PCR-buffer 2.5 μL，MgCl2(2.5 mmol/L) 3 μL，dNTPs (2.5 mmol/L) 2μL，Taq DNA聚合酶1.25 U，上、下游引物(25 μmol/L)各1 μL，总体积25 μL。反应条件为：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min、72 ℃ 30 s、35个循环，72 ℃ 5 min。产物经1.5%琼脂糖凝胶进行电泳分析，并在成像系统中成像。

2 结果

2.1 病原菌检测

72例患者共检出细菌100株，革兰阴性杆菌75株(75.0%)，肺炎克雷伯菌有30株(30%)。

2.2 肺炎克雷伯菌的耐药性

肺炎克雷伯菌对亚胺培南无耐药菌株产生，对头孢吡肟、阿米卡星的耐药率较低，而对青霉素类和第2、3代头孢类药物耐药率均较高。见表1。

表1 肺炎克雷伯菌对不同抗菌药物的耐药性(n=30)

2.3 AmpC基因检出结果

本次检出的30株肺炎克雷伯菌中，有11株琼脂糖电泳在445 bp出现单一条带，证明共检出AmpC阳性菌株11株(36.7%)，见图1。

注： 1为AmpC阳性株，2为阴性对照株，M为标准分子量参照物

3 讨论

流行病学研究显示CAP是导致我国患者死亡的主要原因之一。CAP好发于老年人，主要由革兰阴性菌感染引起[8]。由于老年患者生理功能的衰退使其呼吸道的异物和分泌物不易排出，且随年龄增长免疫力降低，并且合并有多种基础疾病，容易发生CAP[9]。合理选择抗菌药物，迅速有效地控制CAP是治疗的关键。肺炎克雷伯菌是CAP的重要病原菌[10]。本文72例患者共检出细菌100株，革兰阴性杆菌75株，占75.0%，肺炎克雷伯菌有30株，占30%。表明CAP致病菌中克雷伯菌所占比例较高。

肺炎克雷伯菌对多种抗菌药物具有天然耐药性，产AmpC酶是导致细菌对抗菌素耐药的主要酶类，多由普通的β-内酰胺酶基因突变产生，主要由肠杆菌科细菌产生，呼吸道感染克雷伯氏菌也能合成[11-12]。本文在30株肺炎克雷伯菌中，检出AmpC阳性11株，占36.7%。AmpC酶可水解青霉素类、第2、3代头孢菌素、头霉素类和β内酰胺酶。由于很多酶抑制剂对AmpC酶的抑制作用较弱，加之编码AmpC酶基因的质粒可在不同菌属细菌间水平传播，因此产AmpC酶细菌的检测和药敏分析得到了广泛重视[13]。本文结果显示肺炎克雷伯菌对亚胺培南无耐药菌株产生，对头孢吡肟、阿米卡星的耐药率较低，而对青霉素类和第2、3代头孢类药物耐药率较高。说明肺炎克雷伯菌对大多数新型广谱β内酰胺类抗生素以及含酶抑制剂复合制剂均高度耐药，但对亚胺培南和头孢吡肟仍保持高度敏感性，对阿米卡星也有一定的敏感性。为此在临床治疗中，建议用碳青霉烯类或第4代头孢菌素抗感染治疗[14]。

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(2015-05-25收稿，2015-07-08修回)

中文编辑： 吴昌学； 英文编辑： 赵 毅

The Detection of Drug Resistance and Producing AmpC Enzyme Gene Condition ofKlebsiellapneumoniaein Community-Acquired Pneumonia

WEI Juanjuan1, SHI Xiaoyan2

(1.DepartmentofLaboratory,theTraditionalChineseMedicineHospitalofYulinCity,Yulin719000,Shaanxi,China;2.DepartmentofLaboratory,XingyuanHospitalofYulinCity,Yulin719000,Shaanxi,China)

Objective: To investigate the drug resistance and producing AmpC enzyme gene conditions ofKlebsiellapneumoniaeof community-acquired pneumonia. Methods: Sputum from 72 CAP patients was collected for Klebsiella pneumoniae, and they were given eight different kinds of drug-resistant testing, while the AmpC enzyme gene expression were detected with PCR. Results: One hundred bacteria strains were detected from 72 patients, among them 30 strains (30%) wereKlebsiellapneumoniae. TheKlebsiellapneumoniaestrains showed no drug resistance to imipenem, and showed low resistance to cefepime and amikacin, and its resistance to penicillins, second and third generation cephalosporins were higher. In 30Klebsiellapneumoniaestrains, AmpC of 11 (36.7%) strains were positive. Conclusion:Klebsiellapneumoniashows higher drug resistance to penicillins, second and third generation cephalosporins, producing AmpC enzyme gene rate is high.

community-acquired pneumonia;Klebsiellapneumoniae; beta-lactamases; drug resistance

时间：2015-08-07

http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150807.2320.056.html

R563.11

A

1000-2707(2015)09-0966-03

*通信作者 E-mail:weijuanjuan_7615@163.com