低分子量肝素对大鼠肾纤维化的预防作用*

卢 涛， 朱春玲

(1.海口市人民医院 肾内科， 海南 海口 570000； 2.贵州医科大学附院 肾内科， 贵州 贵阳 550004)

低分子量肝素对大鼠肾纤维化的预防作用*

卢 涛1， 朱春玲2*

(1.海口市人民医院 肾内科， 海南 海口 570000； 2.贵州医科大学附院 肾内科， 贵州 贵阳 550004)

目的： 观察低分子量肝素(LMWH)对大鼠肾纤维化的预防作用及机制。方法: 健康SD大鼠54只随机分为假手术组、模型组、LMWH组，后两组采用单侧输尿管结扎术(UUO)制作肾间质纤维化大鼠模型，LMWH组术后予LMWH皮下注射，每组分别于手术后第5天、第10天、第15 天处死6只大鼠，取肾组织HE染色切片通过光镜观察各组大鼠肾组织形态, Masson 染色后进行计算肾间质损伤指数，免疫组织化学方法检测TGF-β1、MMP-2表达。结果: 同期模型组肾间质损伤指数、TGF-β1 表达高于假手术组(P<0.05)，MMP-2 表达低于假手术组(P<0.05)；术后10 d和15 d LMWH组肾间质损伤指数及TGF-β1 表达低于模型组(P<0.05)，MMP-2 表达高于模型组(P<0.05)。结论: LMWH可能是通过抑制TGF-β1表达、促进MMP-2表达，从而减轻UUO大鼠肾小管间质纤维化。

肝素，低分子量； 转化生长因子β； 基质金属蛋白酶； 肾间质； 纤维化

肾小管间质纤维化是指在各种致病因子如炎症、损伤等作用下,间质细胞及细胞间质增多,尤其是基质蛋白合成增加,降解受抑制,造成细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)大量堆积导致肾小管间质纤维化，肾小管周围毛细血管堵塞、有效肾单位大量减少、肾小球滤过率也进一步降低[1]。唐云海等[2]发现山莨菪碱可解除血管痉挛、改善微循环特点，通过下调转化生长因子β1(TGF-β1)表达，改善肾纤维化；王儒柏等[3]报道肾康注射液可改善血循环、抑制系膜细胞增殖等作用，进而改善肾纤维化。而低分子量肝素(low molecular weight heparin, LMWH)除具有抗凝、抗血栓、改善血循环作用外，还具有抑制肾小球系膜细胞及基质增生的作用[4-5],但是否能改善肾间质纤维化方面的报道较少。因此本实验采用LMWH干预，观察肾间质纤维化大鼠肾组织的损伤指数及肾组织的TGF-β1、基质金属蛋白酶-2(Matrix Metalloprteinases，MMP-2)表达的影响，探讨LMWH的抗肾间质纤维化的效应及机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 雄性SD大鼠54只，2月龄，体重150～200克，清洁级，由贵州医科大学动物部提供。实验期间自由饮水，摄食饲料为贵阳医学院动物中心提供的混合饲料，适应性喂养1周后进行实验。室温18～28 ℃，相对湿度62%～80%。

1.1.2 主要试剂 低分子量肝素钙注射液(商品名称：尤尼舒，海南通用同盟药业有限公司 ，批号20060401，国药准字H20010300)。兔抗鼠TGF-β1(编号BA0290)，兔抗鼠MMP-2(编号BA2200)，生物素标记羊抗兔IgG(编号BA1003)，链酶亲和素-过氧化物酶复合物(编号SA1082)，封闭用正常山羊血清(编号AR0009)，DAB显色剂(编号AR1022)，均来自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分组 健康SD大鼠54只，预养一周后，空腹12 h，随机分为模型组、LMWH组、假手术组，每组18只。 模型组及LMWH组采用单侧输尿管结扎术(unilateral ureteral obstruction,UUO)制作肾间质纤维化大鼠模型；假手术组打开腹腔后分离左侧输尿管后即关闭腹腔，LMWH组术后予LMWH 200 IU/(kg·d)皮下注射。各组大鼠均自由进食。

1.2.2 动物造模 10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉，将大鼠固定，以左侧腹为手术切口，去毛备皮，打开腹腔暴露左侧输尿管，在近肾端结扎两处，两结点中间剪断输尿管后缝合，关闭腹腔。

1.2.3 标本采集及处理 每组分别于手术后第5天、第10天、第15 天处死6只大鼠，大鼠经乙醚麻醉后称重，腹部作纵形切口，分离出左肾用生理盐水反复灌洗至发白，摘除肾脏，剔除包膜，横断切取约0.5 cm柱状体2块，用于HE染色、Masson染色及免疫组织化学染色，按说明书进行操作。

1.3 观察指标

1.3.1 肾小管间质损伤指数评分 Masson染色后镜检,肾小管损害程度在低倍镜下(×200)依序单盲(观察者不知标本来源的差异性)观察左上、右上、左下、右下、中间5个肾间质视野，按以下8项指标评分，然后分别计算各个评分的均值，得出肾小管间质损伤指数。肾小管上皮细胞空泡变性：无，0分；轻度局灶变性，1分；中度局灶或轻度弥漫变性，2分；广泛或弥漫中度以上变性，3分。肾小管扩张：无，0分；轻度(相应视野区域<25%)，1分；中度(25%～50%)，2分；重度(>50%)，3分。肾小管萎缩：无，0分；轻度(相应视野区域<25%)，1分；中度(25%～50%)，2分；重度(>50%)，3分。红细胞管型：无，0分；轻度(偶见)，1分；中度(相应视野内<10%的肾小管)，2分；重度(相应视野内>10%的肾小管)，3分。蛋白管型：无，0分；轻度(偶见)，1分；中度(相应视野内<10%的肾小管)，2分；重度(相应视野内>10%的肾小管)，3分。间质水肿：无(肾小管间无间隙)，0分；轻度(轻度局灶小管分离)，1分；中度(轻度弥漫或局灶中度肾小管分离)，2分；重度(肾小管重度分离)，3分。间质纤维化：无，0分；轻度(相应视野区域<25%)，1分；中度(25 %～50%)，2分；重度(>50%)，3分。间质细胞浸润：无，0分；轻度(轻度局灶细胞浸润)，1分；中度(轻度弥漫或局灶中度细胞浸润)，2分；重度(重度细胞浸润)，3分。

1.3.2 TGF-β1及MMP-2 水平 细胞胞浆染上棕黄色为阳性细胞，在400倍光镜(LEICA DM 1 000)下目测5个病变比较明显的视野并计数阳性细胞总数，结果以阳性细胞数/HP×400)表示。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 一般情况

假手术组：大鼠体重稳定，精神状况良好，毛皮有光泽，动作自如，反应灵敏。模型组：大鼠精神逐渐萎靡、消瘦、反应迟钝；LMWH组：精神状况一般，反应灵敏度一般。

2.2 肾小管间质损伤指数评分

假手术组：肾小管结构正常,小管间质无增宽，术后5 d、10 d 、15 d比较差异均无统计学意义(P>0.05)。模型组：UUO 术后 5 d,出现小管间质轻度增宽, 伴有少量炎性细胞浸润及胶原沉积；UUO 术后 10 d可见肾小管间质中度增宽, 肾小管结构破坏,偶有管腔塌陷, 炎性细胞浸润,胶原成分增加；UUO 术后15 d可见肾小管间质损伤程度明显，3个时段肾间质损伤指数比较差异均有统计学意义(P<0.05)。LMWH组：UUO 术后 5 d, 偶有小管间质增宽, 伴有少量炎性细胞浸润及胶原沉积；UUO 术后10 d可见肾小管间质轻度增宽, 肾小管结构轻度破坏, 管腔无塌陷,少许炎性细胞浸润,胶原成分轻度增加；UUO 术后15 d可见肾小管间质中度增宽，管腔无塌陷，较多炎性细胞浸润, 胶原成分较多增加；术后5 d与10 d肾间质损伤指数比较差异无统计学意义(P=1.0)。LMWH组较同期模型组肾间质损伤指数均减轻，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠肾小管间质损伤指数

(1)与同期模型组比较，P<0.05；(2)与模型组第5天相比，P<0.05；(3)与模型组第15天相比，P<0.05

2.3 TGF-β1表达情况

假手术组TGF-β1表达均为阴性，模型组、LMWH组均有阳性表达。模型组随时间推移TGF-β1表达逐渐增加，各时间段比较差异有统计学意义(P<0.05)；术后10 d 、15 d LMWH组较同期模型组TGF-ß表达均减轻，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠肾小管间质TGF-β1表达

(1)与模型组比较，P<0.05;(2)与模型组第5天相比，P<0.05；(3)与模型组第15天相比，P<0.05

2.4 MMP-2表达情况

模型组和LMWH组的大鼠术后5 d、10 d、15 d的MMP-2阳性表达均较假手术组减少，差异有统计学意义(P<0.05)；模型组随时间推移MMP-2表达逐渐减少，差异有统计学意义(P<0.05)； LMWH组较同期模型组MMP-2表达均增强，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 各组大鼠肾小管间质MMP-2表达

(1)与同期模型组比较，P<0.05;(2)与模型组第5天相比，P<0.05；(3)与模型组第15天相比，P<0.05

3 讨论

近年的研究显示肾小管间质病变与慢性肾衰竭进展关系密切。肾间质纤维化几乎是所有慢性肾脏疾病发展到后期的病理学特征,是各种慢性肾脏疾病进展为终末期肾功能衰竭的共同通路。肾间质纤维化病变过程涉及细胞、细胞因子、ECM、生长因子及它们之间的相互作用[1]。在调节因子中, TGF-β1被公认是最主要的前纤维化因子，被誉为发生纤维化的枢纽[6-7]。作为一种强效的致纤维化因子, TGF-β1在肾间质纤维化发生、发展的多个环节起作用。ECM在肾间质的过度沉积是引起肾间质纤维化的主要原因,ECM的降解由细胞外基质降解酶系统介导, 该系统中MMP -2 又称Ⅳ型胶原酶、明胶酶，属于中性金属蛋白酶。基质金属蛋白酶抑制物TIMP-2 是非糖基化的蛋白质，对MMP-2 有高度亲和力，以1∶1的比例与MMP-2 结合，是MMP-2 的主要抑制剂[8]。正常情况下，MMP-2 /TIMP-2 系统处于动态平衡，在病理状态下，MMP-2 /TIMP-2 系统的平衡被打破，可能参与多种肾脏疾病的发生发展过程[1, 9-10]。MMP 表达减少，可使胶原降解减少，导致ECM堆积，转向肾小球硬化、肾间质纤维化[11]。

本实验采用大鼠UUO模型，UUO模型是研究肾间质纤维化最常用的模型。在UUO模型中发生肾盂积水、肾间质纤维化和细胞凋亡。模型组Masson染色显示间质胶原沉积加重，肾小管间质损伤指数升高，提示UUO造模成功;术后5 d、10 d、15 d模型组肾小管间质损伤指数逐渐升高，差异有统计学意义，提示肾小管间质损伤逐渐加重。模型组TGF-β1表达渐增强而MMP-2表达渐减少，该结果与Sommer[12]等报道相符。LMWH是由普通肝素(UFH)酶解或化学降解的方法而得到的,其相对分子质量为2 000～10 000,平均为5 000左右的混合物,本实验中给予LMWH干预治疗后发现术后5 d、10 d、15 d LMWH组均比同期模型组肾小管间质损伤指数减低，差异有统计学意义，提示LMWH干预可减轻肾小管间质纤维化。在LMWH干预后细胞因子TGF-β1、MMP-2表达水平发生改变，术后10 d、15 d LMWH组比同期模型组TGF-β1表达减轻而MMP-2表达增强，差异均有统计学意义，提示LMWH可能是通过对TGF-β1、MMP-2表达的影响从而减轻肾间质纤维化。机制可能包括：(1)LMWH通过抑制TGF-β1 启动子和防止核蛋白与调节性AP-1 位点结合，从而抑制TGF-β1表达[13]，而TGF-β1 可通过激活Smad，激活丝裂原活化蛋白酶通路、刺激核转录因子激活蛋白-1 的形成等机制降低MMP-2 的表达[14]，因此LMWH可通过抑制TGF-β1的表达间接促进MMP-2的表达，促进ECM降解；(2)LMWH通过促进内皮细胞表达细胞外基质降解酶t-PA 活性，促进细胞外基质金属蛋白酶的表达，促进ECM降解，抑制肾小管间质纤维化[15]；(3)ECM的不同成分上均具有LMWH的结合位点,因而LMWH可直接参与对ECM的调控[16]。因为TGF-β1 可通过多种信号途径促进肾纤维化，除了干预MMP-2的表达外，还通过干预其他信号途径调节肾小管间质纤维化的进展。因此在本实验LMWH改善肾小管间质纤维化机制中，LMWH对TGF-β1 和MMP-2的干预中哪个起到更关键的作用，目前尚未可知，有待进一步实验来明确。期待LMWH作为 一种新型抗凝药物，在延缓肾小管间质纤维化的临床应用中得到更广泛的研究和使用。

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(2015-06-10收稿，2015-07-21修回)

中文编辑： 周 凌； 英文编辑： 赵 毅

Preventive Effect of Low-Molecular-Weight Heparin on Renal Fibrosis of Mice

LU Tao1, ZHU Chunling2

(1.DepartmentofNephrology,HaiKouPeople'sHospital,Haikou570000,Hainan,China; 2.DepartmentofNephrology,theAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

Objective: To investigate the preventive effect and mechanism of low-molecular-weight heparin on renal fibrosis of mice. Methods: Fifty- four SD mice were randomly divided into 3 groups: Sham-operation group, unilateral ureteral obstruction group (UUO), and LMWH group. The latter two groups adopted UUO to build models, and LMWH group were injected with LMWH after surgery.6 mice of each group were executed randomly on the days 5, 10, 15 after surgery. Immunohistochemistry was performed on obstructed renal tissue to detect TGF-β1 and MMP-2 expression. Histological studies were also performed by HE and Masson staining. Results: The tubulointerstitial damage indexes, the expression of TGF-β1 were significantly higher than that of sham-operation group (P<0.05), the expression of MMP-2 was significantly lower than that of sham-operation group (P<0.05); On 10 d and 15 d after surgery, the tubulointerstitial damage indexes and the expression of TGF-β1 in LMWH group were significantly lower than that of UUO group (P<0.05), the expression of MMP-2 was significantly higher than that of UUO group (P<0.05). Conclusion: LMWH may attenuate development of tubulointerstitial fibrosis by down-regulation the expression of TGF-β1 and up-regulation of the expression of MMP-2 in UUO mice.

heparin, low-molecular-weight; transforming growth factor beta; matrix metalloproteinases; renal interstitium; fibrosis

时间：2015-08-07

http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150807.2314.052.html

R692

A

1000-2707(2015)09-0943-04

*通信作者 E-mail:gyzcl@medmail.com.cn