广西黏虫虫源地蜜源植物花蜜游离氨基酸成分分析

范新涛，闫凤鸣，朱家超，吴 彪，王高平

(河南农业大学植物保护学院，河南郑州450002)

黏虫Mythimna separata(Walker)是夜蛾科重要的一种农业害虫，需要取食补充营养才能进行正常的迁飞、发育和繁殖.黏虫卵巢在成虫取食后才能发育成熟，不同种类和浓度的补充营养物对生殖和发育具有影响［1－3］。迁飞地蜜源植物分泌花蜜情况可能是黏虫是否能够进行迁飞和发生量的重要影响因素之一。研究表明，黏虫危害程度与虫源地、迁飞中转地紫云英Astragalus sinicus L.种植面积呈极显著相关性，而与该地区的油菜Brassica napus L.种植面积的相关性不明显［4］。有研究表明，成虫期取食葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖、海藻糖、棉子糖、甘油、甘露醇等的黏虫能够正常生殖，而摄食水、木糖、山梨糖、乳糖、糊精、淀粉、糖原的黏虫成虫仅产极少数卵［5］。紫云英花蜜中含有葡萄糖、果糖和蔗糖3种主要的糖，而油菜花蜜中主要有葡萄糖和果糖2种糖，同时还存在少量的麦芽糖。刘保玲等［6］利用氨基酸自动分析仪分析了黏虫蜜源植物花蜜中游离氨基酸成分，在油菜和紫云英花蜜中检测到17种常见蛋白氨基酸。花蜜中氨基酸成分对蝴蝶产卵量起到积极的作用已经被证实，同时花蜜中氨基酸成分对雄蝶也存在影响作用［7，8］。本研究对黏虫虫源地广西桂林地区紫云英和油菜花蜜中的游离氨基酸成分进行了分析，将有助于揭示紫云英比油菜花蜜更适合黏虫补充营养的内在原因。

1 材料与方法

1.1 油菜和紫云英花蜜的收集

于2013－03－19，在广西桂林永福县罗锦镇随机选取油菜和紫云英植株，用毛细管法收集其花蜜40～50 μL，放置于4℃冰箱保存。

1.2 天然花蜜中全谱氨基酸的测定方法

利用液质联用(LC-MS/MS Q-TRAP)同位素内标法检测全谱游离氨基酸。包括20种蛋白氨基酸和21种非蛋白氨基酸:磷酸乙醇胺、牛磺酸、乙醇胺、磷酸丝氨酸、瓜氨酸、1-甲基组氨酸、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、3-甲基组氨酸、a-氨基已二酸、α-氨基正丁酸、鸟氨酸、羟基脯氨酸、肌氨酸、精氨(基)琥珀酸、肌肽、鹅肌肽、羟化胍氨酸、β-氨基异丁酸、胱硫醚、同型半胱氨酸。

1.2.1 样本衍生化处理 移取40 μL样品置于试管内，加入 10 μL磺基水杨酸，漩涡混匀 30 s，10 000倍重力加速度离心2 min沉淀蛋白。移取10 μL上层液置于另一试管。加入40 μL标记缓冲液，漩涡混匀，旋转离心。移取10 μL上层液置于另一试管。每个样品管中加入5 μL稀释的iTRAQ试剂，漩涡混匀，旋转离心。于室温下孵化至少30 min。管中加入5 μL羟胺，漩涡混匀，旋转离心。每支管中加入32 μL内标，漩涡混匀，旋转离心。使用液质联用质谱仪检测样本。

1.2.2 液相条件和质谱参数 液相条件:柱温为50℃，进样量3 μL，A流动相为水和0.1%甲酸混合液，B流动相为乙腈和0.1%甲酸混合液;质谱检测梯度见下表1。根据分析出氨基酸峰值计算花蜜中氨基酸的含量，质谱检测花蜜中全谱氨基酸中各氨基酸种类。

表1 质谱检测梯度表Table 1 The gradient of mobile phases for MS detection

2 结果与分析

油菜和紫云英花蜜中检测出的游离氨基酸包括蛋白质组分氨基酸和非蛋白氨基酸，分别见表2和表3。

从表2可以看出，花蜜中存在20种蛋白质组分氨基酸中的19种，未检测到半胱氨酸。其中色氨酸在2种花蜜中所占蛋白质组分氨基酸总量的比例最低，分别为0.29%和0.14%，甲硫氨酸其次，分别为 0.46%和 0.53%。

表2 油菜和紫云英花蜜中20种游离蛋白质组分氨基酸含量Table 2 Content of 20 free protein amino acids in nectar of milk vetch and rape

续表 Continuing table

从表2可以看出，同种氨基酸在2种花蜜中的比例各不相同。在油菜花蜜中，甘氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、丙氨酸、谷氨酸和脯氨酸含量明显高于其他氨基酸;而在紫云英花蜜中，天门冬酰胺所占比例最高，其含量可达 1 323.93 mg·L－1，其次是丝氨酸，达271.08 mg·L－1。在紫云英花蜜中，谷氨酰胺、天门冬氨酸、组氨酸、苏氨酸、丙氨酸和谷氨酸含量也均在100 mg·L－1以上。

紫云英花蜜中各蛋白质组分氨基酸含量明显高于油菜花蜜中的各氨基酸含量。其中天门冬酰胺是油菜花蜜中的271.80倍，天门冬氨酸含量也是油菜花蜜中的54.83倍，苯丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸和苏氨酸分别是油菜花蜜中同种氨基酸的 28.49 倍、25.85 倍、22.19 倍、21.89 倍和24.69倍，含量最低的色氨酸也是油菜花蜜中氨基酸的9.13倍。

表3 油菜和紫云英花蜜中的非蛋白质组分氨基酸种类及含量Table 3 Content of free non-protein amino acids in nectar of milk vetch and rape

从表3可以看出，紫云英和油菜花蜜中分别检测出12种和10种非蛋白质组分氨基酸。这些非蛋白质组分氨基酸主要有牛磺酸、乙醇胺、瓜氨酸、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸和鸟氨酸。其中以γ-氨基丁酸含量最高，油菜和紫云英2种花蜜中含量分别为45.19、48.76 mg·L－1，其次是乙醇胺，在油菜和紫云英花蜜中含量分别为13.45、17.11 mg·L－1。

紫云英花蜜中还存在磷酸丝氨酸和3-甲基组氨酸，这2 种成分含量只有 0.04 mg·L－1和 0.45 mg·L－1，但是在油菜花蜜中并未检测到。

3 结论与讨论

1)紫云英和油菜花蜜均检测出19种蛋白质组分氨基酸，紫云英和油菜花蜜分别检测出12种和10种非蛋白质组分氨基酸，油菜花蜜未检测出磷酸丝氨酸和3-甲基组氨酸。紫云英花蜜中牛磺酸和α-氨基正丁酸含量低于油菜花蜜，而其他氨基酸含量则高于油菜花蜜。油菜花蜜中甘氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、丙氨酸、谷氨酸和脯氨酸含量明显高于其他氨基酸成分;而在紫云英花蜜中，天门冬酰胺所占的比例最高，其次是丝氨酸。

2)NICOLSON［9］分析了芦荟属 Aloe和刺桐属Erythrina花蜜中的氨基酸成分，16种芦荟属植物的花蜜氨基酸总量各不相同;10种刺桐属植物的氨基酸总量也不同;在20种常见氨基酸中，有些氨基酸成分在花蜜中能够检测到，但有些氨基酸并未检测到。西葫芦Cucurbita pepo雌花和雄花花蜜中，除了存在16种蛋白氨基酸外，同时还存在牛磺酸、β-丙氨酸、a-氨基丁酸和γ-氨基丁酸等非蛋白氨基酸，以脯氨酸含量最高，苏氨酸、组氨酸、β丙氨酸和丙氨酸依次降低;雌花和雄花花蜜氨基酸的含量也存在不同［10］。刘保玲等［6］利用氨基酸自动分析仪分析了黏虫蜜源植物花蜜中游离蛋白质组分氨基酸成分，在油菜和紫云英花蜜中检测到17种蛋白质组分氨基酸，油菜花蜜中苏氨酸、丙氨酸和谷氨酸含量最高，达100 mg·kg－1以上，精氨酸含量最低，只有2.78 mg·kg－1;而紫云英花蜜只有苏氨酸含量达100 mg·kg－1以上，其余氨基酸含量都低于100 mg·kg－1，酪氨酸含量最低，只有0.37 mg·kg－1。本研究所得的蛋白氨基酸数据与刘保玲等［6］的研究结果不同，分析其原因可能有3方面:(1)品种不同。在单一植物间、同一种群和不同种群间花蜜成分花蜜氨基酸成分变化都均比较明显，同时氨基酸含量也会随着花龄变化而变化，通常新花含量低、中龄花含量较高(急剧增长的天冬氨酸是个例外)、老花中很高［11］;(2)环境条件不同。二氧化碳的浓度可引起花蜜氨基酸成分的变化，温、湿度也影响花蜜的产生;(3)生长条件不同。花蜜氨基酸组成也受植物生长条件的影响，如麦仙翁在增施化肥条件下可显著改变花蜜氨基酸的组成，特别是增加谷氨酰胺、脯氨酸和天冬酰胺的比例。

通常情况下植物所产的花蜜量极少，很难直接用采集花蜜饲喂昆虫的方法来研究花蜜对昆虫的影响，分析花蜜中存在的各种成分、研究组配模拟花蜜对昆虫的影响是一种更容易实现的方法。花蜜中氨基酸的独特之处在于这些化合物对花蜜口感味道的影响，氨基酸比糖成分的化学结构更加多样性，并且味道也随着浓度的变化而发生变化。

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