实时定量PCR法分析2型糖尿病患者肠道乳酸杆菌菌种数量改变分析

徐东明 ,张驰,张希泉,赵洪霞

1.哈尔滨铁路疾病预防控制中心,黑龙江哈尔滨 150081;2.佳木斯大学附属第一医院,黑龙江佳木斯 154002

正常人体中的肠道中,分布有多种益生菌、条件致菌病和少数致病菌,这些病菌能够发挥拮抗病原微生物定植、刺激机体免疫机制等的作用,进而维持肠道的正常结构和生理机能。肠道菌群如果失调,就可能引起一系列的肠外疾病,2型糖尿病、肥胖等都是肠道菌群失调可能诱发的疾病[1]。该研究就该院收治的2型糖尿病患者作为研究对象,通过实时定量PCR法对其肠道乳酸杆菌菌种数量的变化进行分析,并探讨其对患者的血糖、血脂代谢的影响。具体报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取在该院收治的2型糖尿病患者100例作为研究对象,所有患者均符合世界卫生组织制定的糖尿病诊断标准。排除标准[2]：合并肝肾功能损伤的患者；合并甲状腺疾病及其他内分泌疾病的患者；合并肿瘤的患者；近期(4周内)有使用胃肠道相关治疗药物或者抗生素、微生态制剂的患者；近3个月内有使用降脂药物的患者。其中,男性患者52例,女性患者48例,其年龄在35~78岁之间,平均年龄为(57.9±3.3)岁。

选择同期在该院接受健康体检的正常人100例作为研究对象,男女各50例,年龄在33～78岁之间,平均年龄为(56.2±3.6)岁。

表1 两组实验者血糖、血脂水平的比较(x-±s)

表2 两组实验者总乳酸杆菌及具体菌属的数量比较(Xlgx± Slgx拷贝数/克湿便)

两组实验者的性别、年龄等方面的比较均差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。

1.2 方法

采集两组实验者的空腹血液标本和餐后2 h血液标本,分别对其空腹血糖值、糖化血红蛋白水平、血脂相关指标(血清总胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白以及甘油三酯等)以及餐后2 h血糖值等指标进行测定和比较。

采集实验者的粪便样品,保存在零下70 ℃的环境中,对其进行预处理和细菌总DNA提取。称取湿重粪便样品,加灭菌PBS振荡混合后做离心处理,采集上清液(菌体)并反复洗涤后再次离心,收集沉淀中的菌体,以灭菌PBS悬浮,离心并多次洗涤后保存获得的菌体沉淀。严格按照细菌基因组DNA提取试剂盒上的操作要求对菌体沉淀中的细菌总DNA进行提取,行1.0%的琼脂糖凝胶电泳分析后将细菌DNA溶液置于零下20 ℃的条件下保存。

参照文献[3],根据乳酸杆菌菌种的16s rRNA基因序列,设计特异性PCR引物。将标准菌株的PCR产物依次进行切胶和回收处理后得到的DNA片段作为荧光定量PCR的标准品,计算并制作标准曲线,再根据10倍系列稀释的标准品反应时的荧光扩增信号,获取乳酸杆菌菌种的标准曲线。将提取到粪便样品DNA分别进行乳酸杆菌总属及其具体菌种16s rRNA荧光定量PCR反应,反应体系、条件等一致。将粪便细菌的DNA样品和10倍系列稀释的标准品同时做实时PCR反应,每个样品做2个平行复孔,在反应结束之后通过融解曲线的分析判断PCR产物的特异性,并计算单位量粪便样品中待测细菌基因的拷贝数。

1.3 统计方法

该次实验数据采用SPSS19.0软件进行统计学分析,其中计量资料对比采用t检验,计数资料对比采用c2检验,以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

比较糖尿病患者和健康志愿者的血糖、血脂等主要观察指标的区别,可见糖尿病患者各项指标均显著高于健康志愿者,比较差异有统计学意义(P<0.05),见表1。

比较糖尿病患者和健康志愿者的乳酸杆菌菌属及具体菌种的数量,可见除植物乳杆菌外,总乳酸杆菌及嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌的比较,两组实验者均差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

对乳酸杆菌数量与血糖、血脂各项指标之间的关系进行分析,可见其与血脂各项指标均成负相关,但与低密度脂蛋白胆固醇之间的相关性,差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

作为肠道中普遍存在益生菌,乳酸杆菌包括了嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌等多种菌种,其在维持肠道正常结构和生理机能上发挥重要作用,但对人体代谢机制的影响并不十分清晰。

实时定量PCR法能对目标细菌16s rRNA V3区序列设计特异性引物,并通过荧光定量PCR扩增技术检测样本,特异性高。该文经实时定量PCR法对2型糖尿病患者和健康志愿者肠道内的乳酸杆菌菌种数量进行了测定和比较,结果可见2型糖尿病患者的总乳酸杆菌以及嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌等具体菌种的数量均显著增加,与正常人比差异有统计学意义,而将其与实验者的血糖、血脂水平进行相关性分析,则可见其改变与血脂水平呈负相关,提示长期高脂饮食可能是造成肠道菌群失调,代谢紊乱,诱发2型糖尿病的原因之一。肠道菌群无法正常转化不溶性糖类和蛋白质而将葡萄糖分解为乳酸,参与胆固醇代谢,进而导致2型糖尿病。这也提示在对患者进行治疗的时候可以通过饮食调节乳酸杆菌菌种数量改善患者的血糖、血脂代谢失调。

[1] 宋美茹,姚萍. 应用实时荧光定量 PCR 定量检测溃疡性结肠炎肠道大肠埃希菌、乳酸杆菌及双歧杆菌属的变化[J].中国微生态学杂志,2012,24(3):239-241.

[2] 唐源淋,张绍衡,郭亚兵,等. 两种方法定量分析肝硬化患者肠道菌群改变的比较[J]. 现代消化及介入诊疗,2012,17(1):5-7.

[3] 刘婷婷, 蔡德鸿. 实时定量PCR法分析2型糖尿病患者肠道乳酸杆菌菌种数量的改变[J]. 世界华人消化杂志,2012,20(15):1359-1362.