河南省2011-2013年小肠结肠炎耶尔森菌监测结果分析

穆玉姣,张白帆,李孟磊,赵嘉咏,景怀琦,夏胜利

河南省2011-2013年小肠结肠炎耶尔森菌监测结果分析

穆玉姣1,张白帆1,李孟磊1,赵嘉咏1,景怀琦2,夏胜利1

目的 了解河南省小肠结肠炎耶尔森菌的宿主分布、血清学及毒力基因情况。方法 于2011—2013年采集腹泻病人粪便、各类家禽家畜粪便、苍蝇以及生熟肉制品涂抹标本，共6 057份，采用冷增菌方法进行目的菌分离。对不同宿主样本中分离到的小肠结肠炎耶尔森菌进行系统生化鉴定、血清学分型和毒力基因PCR检测。结果 6 057份样本中共分离出288株小肠结肠炎耶尔森菌，检出率为4.75%。所分离的小肠结肠炎耶尔森菌主要血清型是O∶8和O∶5，生物分型以1A为主。O∶3血清型多具有致病性，其中以猪分离株最多。结论 河南省小肠结肠炎耶尔森菌在人群和各类动物中均有存在，猪是小肠结肠炎耶尔森菌致病性菌株的主要宿主。

小肠结肠炎耶尔森菌; 宿主；血清学分型; 毒力因子

小肠结肠炎耶尔森菌广泛分布于自然界多种动物。家畜家禽带菌率较高，人类与受感染的家禽家畜接触,动物粪便污染水源、食品或者土壤等均可造成散发感染甚至疫情暴发。小肠结肠炎耶尔森菌是在冷藏温度下生长的少数几种肠道致病菌之一，冰箱中储存的肉及肉制品也可能成为传染源,造成小肠结肠炎耶尔森菌病的食源性传播。

1 材料与方法

1.1 标本来源 2011-2013年河南省小肠结肠炎耶尔森菌监测点根据《全国小肠结肠炎耶尔森菌病监测方案》要求，在监测点郑州、睢县和登封采集腹泻病人粪便、家禽家畜粪便、生熟食品等各类标本6 057份。

1.2 试剂与仪器 耶尔森菌选择性培养基及配套抗生素为美国BD公司产品，0.1 mol/L磷酸盐缓冲盐水(pH7.4，改良PBS)、克氏双糖铁琼脂(KIA)、动力吲哚尿素培养基(MIU)均购自上海市疾病预防控制中心，哥伦比亚营养琼脂购自英国Oxoid公司。小肠结肠炎耶尔森菌分型血清购自日本生研株式会社 (包括O∶1,2、O∶3、O∶5、O∶8、O∶9),其它型别血清购自中国生物药品鉴定所，菌株鉴定用API20E生化板条及配套试剂均系购自法国生物梅里埃公司，PCR扩增相关试剂及引物合成来自上海生工，PCR热循环仪、电泳仪、凝胶成像仪均为美国Bio-Bad公司产品。

1.3 菌株分离培养 将采集的标本接种于10 mL改良PBS中,4 ℃冷增菌,分别于第7、14、21 d接种耶尔森菌选择性培养基,25 ℃培养24～36 h,挑取疑似菌落转种克氏双糖斜面25 ℃培养24 h,选择克氏双糖+/-、不产气、H2S-,接种于尿素培养基及半固体培养基,选择尿素酶+、25 ℃培养动力+、37 ℃培养动力-,镜检为革兰阴性杆菌或椭或球杆菌细菌者,使用Api 20E生化板条做系统生化鉴定。

1.4 血清学分型 生化反应是小肠结肠炎耶尔森菌鉴定的主要依据，同时还可以作为生物分型的依据，参照文献[1] 。生化鉴定为小肠结肠炎耶尔森菌的菌株进行血清学分型，并设盐水对照。

1.5 毒力相关基因检测 PCR〔2〕检测小肠结肠炎耶尔森菌粘附侵袭点基因(ail)、耐热性肠毒素基因(ystA)、生物1A型携带的肠毒素基因(ystB)、粘附素(yadA )、yop调节子转录活化作用因子(virF)。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳分离(170 V， 30 min)。引物序列见表1。

表1 各检测基因PCR扩增引物序列

2 结 果

2.1 标本检出情况 共分离出288株小肠结肠炎耶尔森菌，检出率为4.75%，分别分离自10种动物宿主中，其中猪源株所占比例最高为31.25%(90/288)，其次为鸡源株27.08%(78/288)；其它依次为鸳鸯源株13.19%(38/288)，羊源株8.68%(25/288)，狗源株6.25%(18/288)，鸭源株5.21%(15/288)，腹泻病人源株3.13%(9/288)，苍蝇源株2.08%(6/288)，牛源株1.74%(5/288)，兔源株1.39%(4/288)。

2.2 菌株分型结果 对288株小肠结肠炎耶尔森菌进行了血清学和生物学分型。O∶8血清型菌株所占比例最高，为11.81%(34/288)，生物型全部为1A型； O∶5型为11.11%(32/288)，生物型全部为1A型；O∶3型为9.72%(28/288)，其中24株为3型生物型，4株为1A生物型。

2.3 95株已分型菌株在宿主中的分布情况 O∶3血清型是猪分离株的优势型别，鸡分离株的优势血清型是O∶5和O∶8；大多数宿主分离株的生物分型以1A为主，其中狗、鸡、牛、兔、鸭、羊、鸳鸯生物分型均为1A型；腹泻患者、苍蝇和猪分离株有3型生物型，其中猪分离株中50%为生物3型。见表2。

2.4 毒力基因检测结果 对95株已分型菌株进行毒力基因ail、ystA、ystB、yadA 和virF检测，结果见表3。ail+、ystA+、ystB-、yadA+、virF+或ail+、ystA+、ystB-、yadA-、virF-为致病菌，ail-、ystA-、yadA-、virF-为非致病菌株[4]。O∶3型菌株绝大多数为致病性菌株，部分O∶3型和全部的O∶5、O∶8、O∶9型为非致病菌株。

表2 菌株宿主-血清型分布情况(株)

表3 95株小肠结肠炎耶尔森菌的毒力基因分布情况

3 讨 论

小肠结肠炎耶尔森菌在动物宿主中分布非常广泛，尤其在是家禽家畜中，猪、鸡、狗等可成为健康带菌者。人与受感染的家禽家畜接触，或接触被感染动物粪便污染的水,食品，均可以造成感染。我们对2011-2013年河南省分离的288株小肠结肠炎耶尔森菌的宿主及其血清型,生物分型,致病性的检测结果进行了分析，发现腹泻病人、家禽家畜、昆虫中均有分布，其中猪株源检出率最高。

河南省主要流行的血清型是O∶5,O∶8，但这些菌株生物分型均为1A型且缺乏毒力因子[3]，说明河南省流行的O∶5和O∶8血清型不具有致病性，这与河南以往的监测结果一致[4]；但分析2例来源于人的血清型分别为O∶5和O∶8的菌株发现，其生物分型和毒力基因显示不具有致病性，但病人有腹泻等临床表现，可能是毒力基因丢失或者是合并有其它致病菌感染，原因还有待进一步分析。大量实验证明，致病性耶尔森菌遗传背景复杂，染色体DNA指纹分析具有多态性[5]，因此区分有无致病性，不仅需要PCR技术，而且还需要生化鉴定,血清凝集实验等辅佐。其次是O∶3血清型，通过对其生物分型,毒力基因及宿主的分析发现，我省分离出的28株O∶3血清型中有24株具有致病性。这24株致病菌株中，21株来源于猪，2株来源于苍蝇，1株来源于腹泻病人，说明猪是小肠结肠炎耶尔森菌致病性菌株的主要宿主。河南是生猪养殖大省，猪-人传播存在很大的可能性，但动物致病株与人致病株的同源性，有待进一步研究。从苍蝇中分离出致病性小肠结肠炎耶尔森菌，说明昆虫在食物污染上起重要作用。

综上，几乎所有家禽中均有小肠结肠炎耶尔森菌自然感染的现象，但其是否具有致病性，需要生物化学,血清凝集和PCR多种实验一起验证。猪是致病性菌株重要的动物宿主[6]，需要加强猪群检疫,卫生处理等工作。由于我国抗生素使用比较混乱，腹泻病人在就诊前大多已经服用过抗生素，致使从腹泻病人中分离菌株较少，可能有未发现的感染病例存在。

[1]Wang H, Jing HQ, Zhu GC, et al.Yersiniaenterocolitica[M]. Beijing: People’s Publishing House, 2004: 16-18. (in Chinese) 汪华,景怀琦,朱凤才,等.小肠结肠炎耶尔森氏菌[M].北京：北京人民出版社,2004：16-18.

[2]Thoerner P, Bin Kingombe CI, Bogli-Stuber K, et al. PCR detection of virulence genes inYersiniaenterocoliticaandYersiniapseudotuberculosisand investigation of virulence gene distribution[J]. Appl Environ Microbiol, 2003, 69: 1810-1816.

[3]Xiao YC, Wang X, Qiu HY, et al. Study of biotyping for pathogenicY.enterocoliticastrains in China[J]. Chin J Zoonoses, 2010, 26(7): 651-653. (in Chinese) 肖玉春，王鑫，邱海燕，等.中国致病性小肠结肠炎耶尔森菌生物分型研究[J].中国人兽共患病学报,2010.26(7)：651-653.

[4]Li ML, Mu YJ, Dang LC, et al. Surveillance analysis ofYersiniaenterocoliticain Henan Province from 2007 to 2010[J]. Chin J Zoonoses, 2013, 29(3): 312-315. (in Chinese) 李孟磊，穆玉姣，党李成，等.河南省2007-2010年小肠结肠炎耶尔森菌监测分析[J].中国人兽共患病学报, 2013.29(3)：312-315.

[5]Huang Y, Jing HQ. Research ofYersiniainvasive[J]. Chin J Zoonoses, 2009, 25(7): 669-672. (in Chinese) 黄瑛，景怀琦. 耶尔森菌侵袭性研究进展[J].中国人兽共患病学报，2009,25(7)669-672.

[6]Liang J, Wang X, Xiao Y, et al. Prevalence ofYersiniaenterocoliticain pigs slaughtered in Chinese Abattoirs[J]. Appl Environ Microbiol, 2012, 78(8): 2949-2956.

Xia Sheng-li, Email: xiasl@hncdc.com.cn

Surveillance ofYersiniaenterocoliticain Henan Province from 2011 to 2013

MU Yu-jiao1,ZHANG Bai-fan1,LI Meng-lei1,ZHAO Jia-yong1,JING Huai-qi2,XIA Sheng-li1

(1.HenanProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Zhengzhou450016,China; 2.InfectiousDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseasePreventandControl,Beijing102206,China)

We investigated the distribution ofYersiniaenterocoliticain Henan Province. We collected 6 057 samples of stool specimen from diarrhea patients and different domestic animals between 2011 and 2013, as well as flies and the daub specimens of raw and cooked meat products. The bacteria were isolated by cold enrichment method, analyzed by the systematic biochemistery to determine the serotypes and bio-types, and tested the virulence genes by PCR method. As a result, 288 strains ofYersiniaenterocoliticawere detected in 6 057 specimens and the detection rate was 4.75%. The dominant epidemic serotypes of theYersiniaenterocoliticawere O∶8 and O∶5, type 1A was the dominant bio-type. The O∶3 type most have pathogenic and primary pathogenic strains were isolated from swine. In brief, the distribution of the host ofYersiniaenterocoliticawas widespread, while swine was the dominant animal host of athogenic strains.

Yersiniaenterocolitica; host; serotyping; virulence gene

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.09.011

夏胜利，Email：xiasl@hncdc.com.cn

1.河南省疾病预防控制中心，郑州 450016； 2.中国疾控中心传染病预防控制所，北京 102206

Supported by a grant from the Major Special Project of Science and Technology Development (Nos. 2012ZX10004201 and 2012ZX10004203)

R378.2

A

1002-2694(2015)09-0835-04

2014-11-27；

2015-01-22

国家科技重大专项《艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治》(No.2012ZX10004201和No.2012ZX10004203)