贵阳地区2013年腹泻病例中致泻性大肠杆菌的病原监测分析

韦小瑜，游 旅，田克诚，唐光鹏，邹志霆，王定明

·调查防治·

贵阳地区2013年腹泻病例中致泻性大肠杆菌的病原监测分析

韦小瑜，游 旅，田克诚，唐光鹏，邹志霆，王定明

目的 对贵阳地区2013年腹泻病例中致泻性大肠杆菌进行病原检测，为病例的确诊和贵阳地区致泻性大肠杆菌病疫情的预防和控制提供依据。方法 收集2013年贵阳地区感染性腹泻病例粪便标本，接种麦康凯平板，初步生化符合大肠杆菌的菌落，采用多重PCR方法，进行致泻性大肠杆菌种属鉴定(uid基因)和毒力基因(bfpB、escV、stx1、stx2、elt、estIa、estIb、invE、astA、aggR、pic)检测并确定其致病型别。结果 257份腹泻病例粪便标本共检出致泻性大肠杆菌31株，检出率12.1%，其中EPEC11株，1株为典型EPEC，其余10株为非典型EPEC，EAEC15株，ETEC4株，EIEC1株，未检出EHEC。3岁及以下的婴幼儿和18岁及以上的成人是致泻性大肠杆菌感染的主要人群。结论 贵阳地区致泻性大肠杆菌致病型别以EAEC、EPEC为主，婴幼儿和成人是致泻性大肠杆菌感染的主要人群，多重PCR检测方法是诊断致泻性大肠杆菌病的有效检测手段。

感染性腹泻；致泻性大肠杆菌；多重PCR；毒力基因

大肠杆菌(Escherichiacoli，E.coli)是肠道中重要的正常菌群，为宿主提供一些具有营养作用的代谢产物，一般不致病，但某些带有致病基因的大肠杆菌，则引起以胃肠炎为主的一系列的疾病并引起流行，如腹泻、急性炎症、出血性结肠炎、溶血性尿毒综合征、败血症、新生儿脑炎等[1]。河南[2]、北京[3]曾对腹泻病例中多种病原监测时发现致泻性大肠杆菌检出率分别居第1位和第4位，该数据表明致泻性大肠杆菌是中国的一大问题。贵阳地区自1988年报道过婴幼儿致泻性大肠杆菌感染病例后[4]，直至目前，贵阳地区未见腹泻病例中致泻性大肠杆菌的病例报告。本研究收集2013年贵阳地区感染性腹泻病例的粪便标本，采用多重PCR方法，对初步生化符合大肠杆菌的可疑菌落，进行致泻性大肠杆菌种属鉴定(uid基因)和毒力基因(bfpB、escV、stx1、stx2、elt、estIa、estIb、invE、astA、aggR、pic)检测并确定其致病型别，同时了解贵阳地区的菌型分布和毒力基因携带情况，为病例的确诊和疫情的预防和控制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 标本来源 收集贵州省贵阳地区2013年1月—2013年12月贵阳市妇幼保健院、贵阳市第一人民医院、贵阳市第五人民医院257例感染性腹泻病例的粪便标本。感染性腹泻病例定义为每日排便3次或以上、且大便性状有改变(呈稀便、水样便、粘脓便或脓血便等)的门诊病例。将采集的新鲜标本置于卡布运送培养基内，24 h内送往实验室进行检测。

1.2 主要试剂和仪器 卡布运送培养基购自北京陆桥，麦康凯琼脂购自广东环凯，大肠杆菌IMViC生化试剂盒购自广东环凯，5种致泻性大肠杆菌多重PCR检测试剂盒购自北京卓诚惠生,100 bp DNA Marker购自大连宝生物。恒温培养箱(德国，Binder)；PCR仪(德国80W-Tprofessional Gradient 96)，凝胶成像仪Gel Doc2000型(美国，Bio-Rad)。

1.3 致泻性大肠杆菌的分离培养和鉴定 将新鲜标本直接接种于麦康凯平板，分区划线后，36 ℃培养18～24 h，观察菌落形态。挑取平板上5个可疑菌落，进行IMViC初步生化鉴定，符合大肠杆菌生化特征的菌落，保存备用。

1.4 DNA的提取 初步生化符合大肠杆菌的菌落经纯培养后用天根细菌染色体提取试剂盒进行DNA提取，具体提取步骤按照试剂盒说明书进行，提取的核酸保存在-80 ℃冰箱备用。

1.5 5种致泻性大肠杆菌多重PCR检测 按照5种致泻性大肠杆菌多重PCR检测试剂盒说明书进行体系配制。PCR反应采用25 μL体系，包括2×PCR Buffer 12.5 μL，10×Multiplex Assay 2.5 μL，25×PCR Enzyme1 μL，双蒸水7 μL，模板DNA 2 μL。PCR反应条件为：预变性95 ℃4 min；变性95 ℃30 s，62 ℃退火30 s，延伸72 ℃90 s，循环30次；72 ℃ 延伸5 min。

1.6 质量控制 每批试剂盒均以5种致泻性大肠杆菌标准株进行质量控制，分别对5种致泻性大肠杆菌标准株核酸进行多重PCR扩增，每次试验均以试剂盒内阳性对照品作为阳性对照和分子量Marker，以双蒸水作为阴性对照。

1.7 5种致泻性大肠杆菌多重PCR结果分析与判定

1.7.1 对PCR扩增产物进行电泳分析 使用浓度为2%的琼脂糖凝胶，胶的长度为15 cm；电压值为80 V；用试剂盒内阳性对照的PCR产物作为特异性分子Marker。

1.7.2 多重PCR结果判定 所有大肠杆菌(包括致泻和非致泻性大肠杆菌)均有一条uidA的扩增条带(1 480 bp)。在uidA条带的基础上，若有毒力基因条带的扩增，则为致泻性大肠杆菌。根据扩增条带大小，进而确定毒力基因种类，结合毒力组合方式判定最终致病型别。见表1。EAEC的毒力基因中，单独astA基因阳性作为EAEC的判定标准目前存在争议[5-7]，故本研究的EAEC判定标准中仅astA基因阳性的标本未判定为EAEC。

表1 致泻性大肠杆菌毒力基因及阳性判定结果组合

2 结 果

2.1 细菌分离培养及生化鉴定结果 标本培养18～24 h后，观察菌落形态，菌落为桃红色、圆形、湿润、有光泽，直径为2～3 mm，边缘完整，为大肠杆菌的菌落形态特征。初步生化IMViC结果为++--或--++，判断为大肠杆菌后，保存进一步作多重PCR鉴定。

2.2 多重PCR检测结果

2.2.1 多重PCR质量控制结果 每批试剂盒以5种致泻性大肠杆菌标准株核酸进行质量控制，均能对5种致泻性大肠杆菌携带的毒力基因进行很好的条带分离。

2.2.2 病原检测概况 2013年1-12月共收集感染性腹泻病例标本257份，经检测共检出致泻性大肠杆菌31株，检出率12.1%，其中检出EPEC 11株，检出率4.3%，检出ETEC 4株，检出率1.6%，检出EIEC 1株,检出率0.4%，检出EAEC 15株，检出率5.8%，未检出 EHEC。

2.2.3 各种致泻性大肠杆菌毒力基因谱 31株致泻性大肠杆菌中，10株仅escV阳性，判定为非典型EPEC，1株escV与bfpB基因阳性，判定为典型EPEC；2株elt阳性，1株estIb阳性，1株elt与estIb基因均阳性，判定为ETEC；8株pic和aggR基因阳性，3株pic阳性，2株pic和astA基因阳性，1株aggR阳性，1株pic、aggR和astA基因阳性，判定为EAEC；1株invE阳性，判定为EIEC。见图1。

M: Marker and positive; 1-4: ETEC; 5-15: EPEC; N: negative control; 16-30: EAEC; 31: EIEC.

2.2.4 腹泻病例致泻性大肠杆菌的分布 从表1看，男性150例，共检出致泻性大肠杆菌20株，检出率为13.3%，女性107例，检出致泻性大肠杆菌11株，检出率为10.3%。经统计学检验，男女的检出率无统计学意义。257例腹泻病例中，3岁及以下婴幼儿有207例，占总腹泻病例数80.5%，4～17岁学生组腹泻病例仅9例，无致泻性大肠杆菌感染病例，18岁以上的成人组检出率为14%。贵阳地区腹泻病例主要集中在5-10月，共检出致泻性大肠杆菌27株。

表2 贵阳地区腹泻病例致泻性大肠杆菌分布

3 讨 论

致泻性大肠杆菌根据其毒力机制，将其分为肠致病性(EnteropathogenicE.coli,EPEC)、肠出血性(EnterohemorrhagicE.coli, EHEC)、肠产毒性(EnterotoxigenicE.coli, ETEC)、肠侵袭性(EnteroinvasiveE.coli, EIEC)、肠粘附性(EnteroadherentE.coli, EAEC)大肠杆菌5种类型[8]。如何从腹泻患者的粪便中快速而准确地分离鉴定5种致泻性大肠杆菌，是进行流行病学调查、暴发疫情处置及临床研究的基础。

国内大部份实验室在肠致泻性大肠杆菌诊断方面还是以传统的细菌常规培养、 生化、血清鉴定为“金标准”，其鉴定方法存在实验过程繁琐、耗时长、诊断血清因子不全、大肠杆菌的O群不和特定的毒力因子相对应以及根据血清学结果无法判断其致病性等不足。如巴西[9]对805株EPEC血清型凝集的菌株进行特定毒力基因检测发现，有125株未检出毒力因子。随着分子生物学和生物信息学的发展，利用5种致泻性大肠杆菌特异基因进行检测和鉴别的PCR方法得到广泛应用[10-11]，对致泻性大肠杆菌进行菌型划分，得到较好的实验结果。

贵阳地区自1988年报道过婴幼儿致泻性大肠杆菌感染病例后[4]，直至目前，贵阳地区未见腹泻病例中5种致泻性大肠杆菌的病例报告。近年由于国内外致泻性大肠杆菌引起的暴发疫情屡见报道，故对致泻性大肠杆菌的病原诊断和病例监测尤为重要。为了对病例进行病原学诊断，了解目前贵阳地区5种致泻性大肠杆菌的型别分布及毒力基因携带情况，我们采用传统生化鉴定和多重PCR方法鉴定相结合的方法，对贵阳地区2013年采集的257例腹泻病例进行5种致泻性大肠杆菌的检测，结果2013年贵阳地区腹泻病例中致泻性大肠杆菌的检出率为12%，高于我国福建[11]、宁夏[12]报道的检出率，与长治[13]地区的检出率相同。此外，本次监测发现贵阳地区致泻性大肠杆菌菌型以EAEC和EPEC为主，与己报道的河南[2]菌型分布一致，与1986年贵阳地区腹泻病例以ETEC和EIEC为主的菌型分布不同。本研究中EPEC以仅escV阳性的非典型EPEC为主，与北京[3]、长治[13]等地区的研究结果一致，说明非典型EPEC己成为目前国内EPEC主要的流行菌型。其次贵阳地区EAEC以同时携带pic和aggR两种毒力基因为主，本研究EAEC的判定中，未将单独astA毒力基因阳性的菌株明确判定为EAEC，因该毒力基因与EAEC引起的腹泻相关性仍不确切[5-7]。本次监测中虽未检测出EHEC感染病例，但EHEC易引起严重的溶血性尿毒综合症，故仍需加强该病原监测。

本次监测发现贵阳地区3岁及以下婴幼儿腹泻病例占80.5%，婴幼儿及成人是贵阳地区致泻性大肠杆菌病的易感人群，应重点加强婴幼儿监护人员及成人的健康教育宣传。贵阳地区腹泻病例主要集中在7-10月，共检出致泻性大肠杆菌25株(占80.6%)，提示贵阳地区致泻性大肠杆菌病防控的关键时期在夏秋季。

本研究为257例感染性腹泻病例中致泻性大肠杆菌病例的确诊提供病原学依据的同时，揭示了贵阳地区致泻性大肠杆菌的毒力基因携带情况、致病型别在病例中的分布情况，其结果将为贵阳地区致泻性大肠杆菌病疫情的预防和控制提供科学依据。另外，由于致泻性大肠杆菌可以通过食物、水源等方式传播从而暴发疫情，故在进行腹泻病例病原监测的同时，也可采用多重PCR方法，快速检测食品中致泻性大肠杆菌毒力基因以确定病原，对搜索传染源、进行流行病学调查、保证食品安全及疾病防控都具有重要意义。

(致谢：非常感谢贵阳市妇幼保健院赵倩主任、贵阳市第一人民医院王燕主任、贵阳市第五人民医院李丽主任对本项目的支持！)

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Etiological surveillance of DiarrheagenicEscherichiacolifrom infectious diarrheal patients in Guiyang, China, 2013

WEI Xiao-yu,YOU Lü,TIAN Ke-cheng,TANG Guang-peng,ZOU Zhi-ting,WANG Ding-ming

(ResearchInstituteofInfectiousDiseaseControlandPrevention,GuizhouProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Guiyang550004,China)

Patients with infectious diarrhea of 2013 were etiologically detected in this study to provide scientific basis for the confirmation and prevention of the cases of diarrheagenicEscherichiacoliin Guiyang, China. A total of 257 samples of stool specimens of diarrheal patients were collected. Each stool specimen was cultured by streaking on MacConkey agar for isolating diarrheagenicEscherichiacoli. Isolates were conducted with biochemical identification and virulence genes detection by multiplex PCR. The 31 diarrheagenicEscherichiacolistrains were isolated from the total 257 specimens, accounting for 12.1%. Among the 31 diarrheagenicEscherichiacolistrains, there were 11 EPEC strains with 1 typical EPEC strain and 10 atypical EPEC strains, 15 EAEC strains, 4 ETEC strains and 1 EIEC strain. EHEC were not detected. Result shows that EAEC and EPEC were the dominant bacteria type among diarrheagenicEscherichiacoli, which spread mainly among infants aging younger than 3 and adults aging up to 18 in Guiyang. Multi-PCR methods play an important role in diagnosis of diarrheagenicEscherichiacolidisease.

infectious diarrhea; diarrheagenicEscherichiacoli; multiplex PCR; virulence genes

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.09.020

贵州省卫生厅科技基金(No.gzwkj2013-1-079);国家科技重大专项(No.2012ZX10004-212)联合资助

贵州省疾病预防控制中心,贵阳 550004； Email: weixyuse@gzscdc.org

Supported by the Science and Technology Fund of the Health Department of Guizhou Province (No. gzwkj2013-1-079) and grants from the National Key Program for Infectious Disease of China (No. 2012ZX10004-212)

R378.2

A

1002-2694(2015)09-0881-05

2014-10-11；

2015-01-23