结核分枝杆菌耐受活性氧和活性氮基因的研究进展

付 鑫，王爱妍，丁峰山，何时义，杨东君，凌 敏

结核分枝杆菌耐受活性氧和活性氮基因的研究进展

付 鑫，王爱妍，丁峰山，何时义，杨东君，凌 敏

活性氧和活性氮是生物体新陈代谢过程的中间产物，性质活泼，具有强氧化性。激活的巨噬细胞内存在大量的活性氧和活性氮，能够破坏病原菌的生物膜，改变蛋白质的功能，损害DNA的遗传信息，最终抑制或杀死入侵的病原微生物。结核分枝杆菌侵入机体，主要在巨噬细胞内存活并大量繁殖。在氧化和氮化胁迫下，结核分枝杆菌基因在转录水平会发生明显改变，帮助结核分枝杆菌逃逸巨噬细胞的杀伤作用。本文综述了结核分枝杆菌耐受活性氧和活性氮基因的研究进展，并总结了各基因之间的调控通路。

活性氧；活性氮；巨噬细胞；结核分枝杆菌

结核病是仅次于艾滋病的单一致死性传染病[1]。近几年来，随着人口流动性增大，以及青少年免疫力的普遍下降，使结核病发病率不断升高。世界卫生组织统计数据显示，2012年全球结核病患者有860万例，其中耐多药结核病患者占5.23%，结核病与艾滋病双重感染者占到12.79%，死亡130万例，全球还约有300万例的结核病患者没有被发现[2]，而我国又是全球22个结核病高负担国家之一。可见，结核病耐药菌株的蔓延，与HIV双重感染的流行以及发病率的低检出率，都是对我国乃至全球结核病防治工作的一大挑战。

结核病的主要致病菌—结核分枝杆菌(MTB)，是典型的胞内寄生菌，可侵犯周身各器官而发病，以肺结核为主。巨噬细胞是MTB的主要宿主细胞，也是宿主抵抗清除MTB所依赖的主要机制之一。激活的巨噬细胞吞噬作用加强，引发呼吸爆发，产生大量的活性氧和活性氮中间体，从而将入侵的病原菌杀死。然而，被吞入的MTB也会采取相应的措施抵抗或修复活性氧和活性氮造成的损伤。下面就以MTB耐受活性氧、活性氮基因的研究进展做一简要综述。

1 活性氧和活性氮

ROS和RNS的特点是性质活泼，易夺取其他分子的电子，具有强氧化性。正常机体中，ROS和RNS在的产生和清除使其维持在对机体无害的水平，参与机体的防御和一些生理活性物质的生成。ROS和RNS的产生有多种途径，其中NADPH氧化酶和一氧化氮合酶(iNOS)尤为重要。当机体受到微生物入侵时，巨噬细胞通过呼吸爆发(respiratory burst)产生大量的ROS和RNS，进而破坏入侵病原菌的细胞膜、蛋白质、核酸和脂质等，最终消灭病原微生物。

2 结核分枝杆菌抵抗ROS或(和)RNS的机制

ROS和RNS易氧化脂质中的不饱和脂肪酸，使生物膜变脆，通透性改变。蛋白质分布广比例大，也是活性自由基偏爱的靶分子，活性自由基能够使敏感氨基酸残基(His、Pro、Trp、Cys和Tyr等)发生突变，蛋白质肽链断裂，巯基氧化，构象改变，功能改变。DNA双螺旋外侧的嘌呤和嘧啶易被氧化修饰，造成基因突变或单(双)链断裂，改变遗传信息。

2.1 MTB的生物学特性 MTB细胞壁厚，由大量的脂质构成，占到了菌体的20%～40%，胞壁脂质含量越多，疏水性越强，对环境的抵挡作用则越强。其脂质包含索状因子、磷脂、脂肪酸和蜡质等，组成索状因子的分枝菌酸与抗酸性有关，MTB肽聚糖外层包围了大量分枝菌酸，使其能够在巨噬细胞低pH值环境中存活。MTB基因组DNA富含鸟嘌呤G和胞嘧啶C，含量高达65.5%，并且约有250个基因编码特殊的脂类，形成的独特胞壁能使MTB适应巨噬细胞的恶劣环境，逃逸免疫细胞的杀伤作用。

分枝杆菌中功能保守的MmpL11蛋白能够转运包含脂质的分枝菌酸(mycolic acid-containing lipids)到细胞壁，参与细胞壁(膜)的合成[3]。在致病性分枝杆菌细胞壁中存在的聚-L-谷氨酸(Poly-L-glutamate/glutamine)能够抵挡中低水平的氮化胁迫，在高水平氮化胁迫中谷氨酰氨合成酶(glutamine synthetase，GS)的表达和活性则会明显降低[4]。研究证实，氧化胁迫会使鸟分枝杆菌(MAC)膜生成增强，自诱导分子-2(autoinducer-2，AI-2)也参与其中[5]。

2.2 耐受基因及其作用 ROS和RNS的杀菌机制主要是通过破坏病原菌胞内的氧化还原稳态，而菌体通过调控具有氧化还原功能的蛋白的基因表达，消除ROS或RNS，或修复其造成的损伤，从而达到在宿主体内存活的目的。

2.2.1 katG基因 在革兰氏阴性菌中，OxyR是氧化应激的一个重要蛋白，它不仅是ROS的感受器还是转录激活子，能够引发过氧化氢酶和烷基过氧化物酶的表达。尽管MAC的OxyR基因序列保持了完整性，而在多种分枝杆菌的研究中只有耻垢分枝杆菌应对ROS时类似于OxyR，相同实验条件下MTB则局限在KatG[6]。

结核分枝杆菌katG基因编码热稳定性的过氧化氢-过氧化物酶(catalase-peroxidase)，2 223 bp，是一种双功能酶，在抵抗巨噬细胞的氧化激增中发挥重要的作用。其基因的突变、缺失也常导致耐受异烟肼(INH)菌株的出现[7]。MTB-KatG不仅能分解代谢NADPH氧化酶产生的过氧化物[8]，也具有过氧亚硝基还原酶(peroxynitrite reductase)活性[9]，能够分解部分RNS，抵抗巨噬细胞对MTB的杀伤作用。

KatG与经典的过氧化氢酶没有结构相似性，并且作用于H2O2的机制也不相同。KatG通过两个相互作用的辅因子亚铁血红素(heme)和Met-Tyr-Trp (MYW)共价加合物来催化高水平或一般水平的H2O2[10]，而一般的过氧化氢酶并不需要其他的电子传递体。酶促动力学模拟实验显示，在KatG的亚铁血红素接受通道中，进入活性位点的通道被上方的天冬氨酸残基(D141)阻碍，而其他部位的药物结合位点的结合能力较弱，结合D141A突变实验，进一步验证了INH在亚铁血红素通道中的位置[11]。

2.2.2 硫氧还蛋白系统 真核生物及多数细菌中谷胱甘肽是主要的抗氧化巯基化合物，放线菌及结核分枝杆菌中缺少谷胱甘肽系统，更加突出了硫氧还蛋白系统在MTB宿主存活中的作用。目前研究已知，结核分枝杆菌中有三个基因(trxA、trxB、trxC)编码硫氧还蛋白，一个基因(trxR)编码硫氧还蛋白还原酶，一个基因(tpx)表达硫氧还蛋白过氧化物酶。其中NADPH、Trx、TrxR组成了经典的硫氧还蛋白体系。

Trx是在多种生物中被普遍研究的一种蛋白，它们拥有保守的催化结构域WCXXC，以及约12 kDa的低分子量。MTB-Trx与人类Trx同一性为35%[12]。Tpx不能从TrxA获得电子，TrxB和TrxC才是具有功能的二硫化物还原酶[13]，TrxA貌似是一种隐性表达的蛋白，其存在的意义还未知。硫氧还蛋白除能够直接还原过氧化物，作为过氧化物酶的氢供体外，还是MTB-蛋白激酶G(Protein kinase G，PknG)N端的结构域。在PknG中虽然Trx自身并没有活性，但缺失却会严重影响PknG的活性[14]。

TrxR是一种含FAD结构域NADPH依赖型的二聚体酶, 属于吡啶核苷酸-二硫化物氧化还原酶。MTB-TrxR与E.coli-TrxR有45%的同一性和63%的同源性，与人类TrxR有28%的同一性[12]。TrxR通过还原Trx上的-S2为-SH，维持Trx的还原态，而NADPH结构域和FAD结构域对于Trx的还原循环则是必需的[15]。

2.2.3 ahpC基因 烷基氢过氧化物还原酶的还原活性是由两个AhpF和两个AhpC组成的四聚体发挥的。AhpC通过N端保守的半胱氨酸残基的氧化来代谢过氧化物和过氧化亚硝基。为了完成催化循环，半胱氨酸残基必需得被还原,在鼠伤寒沙门氏菌中，AhpF为AhpC提供电子，而MTB缺少AhpF，代替其功能的是AhpD，具有硫辛酰胺应答活性位点。AhpC通过AhpD与二氢硫辛酰胺脱氢酶(Lpd)和二氢硫辛酰胺琥珀酰转移酶(SucB)连接，组成一个过氧化物酶体系[16]。AhpC还能通过TrxC从硫氧还蛋白体系获得电子，但不能通过TrxB[17]。

2.2.4 msrA基因 甲硫氨酸(Met)是重要的甲基供体，Met的氧化会改变一些特殊和重要蛋白质的生物活性，如核糖体蛋白等。msrA编码的甲硫氨酸亚砜还原酶则可以将氧化型甲硫氨酸(Met-O)还原为甲硫氨酸(Met)，修复胞内过氧亚硝基造成的损伤[18]。MTB表达MsrA和MsrB，其中MsrA起到主要的作用，而MsrB在抵抗体内和体外ROS时作用是有限的[19]。X-ray晶体结构显示， 与已知的如牛、大肠杆菌等的MsrA含有三个半胱氨酸残基(CysA、CysB、CysC)不同，MTB-MsrA只有两个功能性的半胱氨酸(Cys-13、Cys-154，相当于 CysA、CysB)。CysC的缺失突变实验显示，MsrA通过硫氧还蛋白体系还原自身活性位点的能力大大受损甚至丧失，这就提示在MTB中，硫氧还蛋白能够直接还原CysA-CysB的二硫键，从而使MsrA功能再生[20]。在耻垢分枝杆菌中，MsrA不仅能够提高菌体在胞内和胞外的存活能力，还能增强对氢过氧化物的敏耐受能力[21]。

2.2.5 lsr2基因 LSR2是一种H-NS(大肠杆菌等革兰氏阴性菌中)样蛋白，在麻风分枝杆菌中首次发现，能与DNA序列AT富集区(尤其是启动子区)结合，调节基因的表达，包括通过水平转移获得的基因，毒力相关因子，以及一些抗原蛋白等[22]。当菌体处于恶劣环境时，LSR2的表达量增加，易于分枝杆菌休眠体的形成，表现出抑制效应。LSR2不仅能够抑制分枝杆菌药物操纵子的表达，对普遍的抗结核药物产生耐药性，还有利于菌体抵抗应激反应。

有研究表明，LSR2虽不能够赋予菌体抵抗RNS的能力，但能耐受ROS。其机制不是通过与铁离子的结合和清除自由基，而是通过与DNA的结合，保护DNA，使其能够抵挡ROS的损伤[23]。耻垢分枝杆菌中，ms4334基因编码的黄素蛋白能够加强LSR2对拓扑异构酶Ⅰ的抑制作用和对ROS的抵抗能力，lsr2基因的敲除突变株虽然对菌株不是致死性的，但会使菌体形态发生改变，对H2O2的敏感性明显增强，M.aviumsubsp.paratuberculosis中lsr2的突变实验也展现了同样的现象[24-25]。相比之下，MTB的lsr2敲除株与野生菌株对ROS的耐受能力并没有表现出明显差异[26]。

2.2.6 nrdH基因 nrdH基因编码NrdH-redoxin，一种小分子量的二硫键还原酶，活性类似于硫氧还蛋白，具有CXXC活性位点，但氨基酸序列却与谷氧还蛋白和mycoredoxins高度相似，可作为核苷酸还原酶的氢供体。吴雷婷等人通过构建重组质粒pET28-nrdH (MTB)，过表达NrdH-redoxin的研究表明，NrdH-redoxin能够提高重组菌的生长能力及对H2O2的耐受能力[27]。NrdH-redoxin在谷氨酸棒状杆菌中的过表达使得菌体表现出对多种ROS的抵抗能力增强，但却依赖于硫氧还蛋白过氧化物酶的存在，进而证明NrdH-redoxin在抗ROS的过程中扮演了过氧化物酶辅助因子的角色[28]。不管是在MTB还是谷氨酸棒状杆菌中，NrdH-redoxin特异性的从TrxR获得电子，而不是从分枝硫醇[29]。

2.2.7 noxR1和noxR3基因 Ehrt和Jia Ruan等人用构建基因组文库液体筛选的方法得到了同时耐受ROS和RNS的两个基因noxR1和noxR3[30-31]。在两个研究中使用的NO供体分别是亚硝酸钠(NaNO2)和亚硝基谷胱甘肽(GSNO)，得到两个不同的基因，表明GSNO和NaNO2对病原菌的影响不是等同的。在巨噬细胞中，谷胱甘肽易与NO结合，生成GSNO，GSNO携带等价的NO穿过细胞壁，释放NO。作为超氧化物，GSNO在杀菌之前得先被菌体吸收，可能更优先影响内部靶点，而NaNO2可能既影响细胞壁，也影响内部靶点。在卡介苗中noxR1的敲除表现出对RNS耐受能力的减弱。但在MTB H37Rv的敲除实验中[32]，并没有表现出耐受能力以及毒力的明显减弱，生长和存活能力也没有受到显著影响。这可能是noxR1缺失可从其他信号通路得到补偿，但具体机制并未明确。

近年来有研究表明HIV阳性患者合并分枝杆菌感染中非结核分枝杆菌(NTM)所占比例不断增大，其中鸟分枝杆菌(MAC)感染最为明显，且多数的MAC菌株已经显示出了多耐药性，这无疑对非结核分枝杆菌病的防治提出了新的挑战。本课题组目前已从HIV/AIDS患者痰液中分离得到一株MAC，成功构建和保存了该MAC的基因组文库，为后续筛选MAC耐受活性氧和活性氮基因，寻找MAC新的药物靶点做好了实验准备。

图1 结核分枝杆菌抗ROS、RNS反应体系示意图

Fig.1MycobacteriumtuberculosisROS and RNS reaction system schematic diagram

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Ling Min, Email:lingmin70@163.com

Research progress ofMycobacteriumtuberculosisgenes resisting to reactive oxygen and nitrogen species

FU Xin,WANG Ai-yan,DING Feng-shan,HE Shi-yi,YANG Dong-jun,LING Min

(DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,GuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Reactive oxygen (nitrogen) species are intermediates of body’s metabolism, active and strong oxidizing property. The microenvironment of activated macrophages have a mass of reactive oxygen and nitrogen species to inhibit or kill the alien pathogens by destroying biofilms, changing the function of proteins and inducing gene mutation.Mycobacteriumtuberculosiscan not only survive in macrophage, but also increase to large numbers. Oxidative or nitrosative stress will result in massive transcriptional changes which can helpMycobacteriumtuberculosisescape from the damage of reactive oxygen and nitrogen species. In this paper, we reviewed the recent research progress ofMycobacteriumtuberculosisgenes resisting to oxidative or nitrosative stress, and summarize the relationship of them.

reactive oxygen species; reactive nitrogen species; macrophage;Mycobacteriumtuberculosis

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.09.015

国家自然科学基金(鸟分枝杆菌在巨噬细胞内生存机制的研究 No.81260245)资助

凌敏，Email：lingmin70@163.com

广西医科大学生物化学与分子生物学教研室，南宁 530021

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.81260245)

R378.91

A

1002-2694(2015)09-0854-05

2014-12-01；

2015-05-06