浸染法改良细菌芽胞染色实验的探索

郑冬超, 樊 佳, 王雨昊, 张 杰, 赵 健, 杨 鑫, 汪 红

(四川大学 生命科学学院, 四川 成都 610065)

浸染法改良细菌芽胞染色实验的探索

郑冬超, 樊 佳, 王雨昊, 张 杰, 赵 健, 杨 鑫, 汪 红

(四川大学 生命科学学院, 四川 成都 610065)

传统芽胞染色法常用孔雀绿染液长时间加热使芽胞着色,该方法用在教学上学生不易操作,成功率低,且孔雀绿染液有毒,加热时容易四溅,对环境造成污染。因此,研究采用一种新的染色法——浸染法,对比孔雀绿浓度及浸染时间对染色效果的影响。结果表明,以10%的孔雀绿为初染剂,浸染10 min时染色效果最佳。采用浸染法操作简单易行,染色效果对比鲜明,学生更易于区分菌体与芽胞的结构,且安全环保。

细菌芽胞染色； 浸染法； 孔雀绿

芽胞是芽胞杆菌属和梭菌属细菌生长到一定阶段在菌体内形成的一种抗逆性很强的休眠体结构,也被称为内生孢子(endospore),通常呈圆形或椭圆形。能否形成芽胞,以及芽胞的形状、大小、位置、是否膨胀等形态特征,是鉴别细菌种类的重要依据。芽胞具有厚而致密的壁,通透性小,不易被普通染料着色。所有芽胞染色法都选用着色力强的染料,并加热以促进标本着色,然后使菌体脱色,保留上的染料,最后经过复染,使菌体和芽胞呈不同的颜色[1-4]。芽胞染色是细菌分类的重要指标,是本科院校开设微生物课的专业学生必须熟练掌握的微生物染色技术,现有的微生物实验教材上介绍的染色方法是Schaeffer-Fulton 氏染色法。该方法采用孔雀绿作为初染剂,需置于酒精灯上持续加热10 min左右,学生不易操作,加热时易造成染液四溅,另外,孔雀绿染液易造成污染,且染色后普遍存在芽胞、菌体着色度及对比度不明显并易褪色等缺点[5-6]。本研究采用浸染法对芽胞染色进行改良探索,并设立一系列孔雀绿浓度及浸染时间梯度,找出最佳染色效果组合条件。将浸染法推广应用到芽胞染色实验教学中,使学生操作更为简便、安全,染色成功率高,对比效果更好,更易区分菌体和芽胞的结构,从而提高实验教学质量。

1 材料与方法

1.1 材料

(1) 菌种:枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)于牛肉膏蛋白胨培养基上37 ℃孵育36～48 h的斜面培养物。

(2) 染色剂:5%、10%、20%孔雀绿水溶液(加热50 ℃左右)、0.5%番红水溶液。

(3) 仪器设备:酒精灯,载玻片,染色皿,接种环,载玻片夹子,Olympus显微影像分析系统(1130万像素数码CCD、最高分辨率1280 × 1024)。

1.2 方法

(1) 取适量培养36～48 h左右的枯草芽胞杆菌斜面菌种,常规涂片、干燥、固定；

(2) 将固定好的涂片用镊子放入5%、10%、20%的孔雀绿染液中,分别浸染5 min、10 min、15 min、20 min,而作为对照的常规Schaeffer-Fulton 氏染色法是滴加5%孔雀绿覆盖涂菌部位,加热至冒蒸气并维持10 min,加热过程中还要注意及时补充染液,切勿让涂片干涸；

(3) 用镊子取出涂片后(尽量滴干染液),用缓流自来水冲洗至流出水呈现无色状态(冲洗不易太久,小心染液沾到身上)；

(4) 用0.5%番红溶液染色1 min；

(5) 用缓流自来水冲洗番红染液至流出水呈现无色；

(6) 待载玻片晾干后,用油镜镜检并进行显微摄像；

(7) 对比芽胞和菌体颜色深浅、对比度、背景清晰度等,客观评价染色效果,将染色结果分为优、良、中、差4 个等级,以芽胞菌体对比度强、背景清晰为优。每种孔雀绿浓度及初染时间的组合实验均至少重复3次。

2 结果

从图1中各组合的芽胞染色结果可以看出:相比对照中传统的Schaeffer-Fulton 氏染色法,以5%孔雀绿溶液作为初染剂,在浸染5～15 min时,芽胞的孔雀绿着色均较浅淡,与菌体的橙红色对比效果不太明显,只有浸染时间在20 min时染色效果较好,菌体、芽胞染色对比明显；以10%孔雀绿溶液作为初染剂,浸染5 min时,芽胞的孔雀绿着色浅淡,染色对比效果不佳,浸染10 min时达到最佳效果,芽胞的鲜绿色与菌体的橙红色对比最为明显,之后15～20 min时,菌体红色受孔雀绿染色影响色泽偏暗,菌体和芽胞染色对比效果降低；当孔雀绿溶液浓度为20%时,芽胞染上的绿色过于浓烈,菌体上残留的绿色无法被彻底冲洗除去,与菌体的红色叠加形成红褐色或褐灰色,颜色对比不显著,难以区分菌体与芽胞的结构,浸染5～10 min时的对比效果稍强于浸染15～20 min。

图1 不同浓度孔雀绿及浸染时间组合下芽胞染色差异

以芽胞和菌体颜色深浅、对比度、背景清晰度等为标准,对不同浓度孔雀绿浓度及浸染时间组合下芽胞染色效果进行了客观评价,结果得出,以5%孔雀绿溶液作为初染剂,在浸染5～15 min时染色效果为中差等,浸染时间在20 min时染色效果良好；以10%孔雀绿溶液作为初染剂,浸染5 min时,染色对比效果中等,浸染10 min时达到最佳的优等效果,芽胞菌体红绿颜色对比度强、背景清晰,而后染色效果随时间增加而降低；当孔雀绿溶液浓度增加为20%时,染色效果降低为中差。具体芽胞染色效果评价见表1。

表1 不同浓度孔雀绿及浸染时间组合下芽胞染色效果评价

3 讨论

经过对不同孔雀绿浓度及浸染时间组合下芽胞染色效果进行对比得知,以10%孔雀绿溶液作为初染剂,浸染10 min时达到最佳的染色效果,芽胞菌体红绿颜色对比鲜明、背景清晰；孔雀绿浓度低或浸染时间过短,会使芽胞着色浅淡,与菌体的橙红色对比不鲜明；而孔雀绿浓度过高或浸染时间增加,会使芽胞的绿色过于浓重,也会使菌体上残留的孔雀绿难以被彻底冲洗掉,从而与菌体复染上的红色叠加为红褐色或褐灰色,降低芽胞菌体红绿对比度,染色效果不佳。

目前已有不少文献对芽胞染色过程进行了改进,如将涂片在初染时进行沸水浴加热[7]、烘箱加热[8]、滤纸覆盖加热法[9-10]、微波炉加热[11-13]、酸水解[6,14]、在初染液中添加适量Tergitol 7等表面活性剂[15],或寻找不同染色剂的最佳浓度配比及染色时间配比[16-18]等,简化并优化实验操作步骤,使染色效果更为突出。

本研究创新性地采用浸染的方法对芽胞染色实验的初染过程进行了改良,并找出了浸染所需的最佳孔雀绿浓度及染色时间,使得实验操作更加简便,学生容易掌握,成功率高,并且操作安全,对环境无污染。可使学生观察到芽胞与菌体之间的显著染色对比,利于其区分芽胞的位置及结构,达到了提高微生物实验教学效果的目的。

References)

[1] 钱存柔,李玲君,梁崇志,等.微生物学实验第[M].3 版.北京:北京大学出版社,1985:20-21.

[2] 陈金春,陈国强.微生物学实验指导[M].北京:清华大学出版社,2005:72.

[3] 沈萍,范秀容,李广武.微生物学实验[M].3版.北京,高等教育出版社,2007:76.

[4] 沈萍,陈向东.微生物学[M].4版.北京:高等教育出版社,2007:76-78.

[5] Schaeffer A B,MacDonald F.A simplified method of staining endospores[J].Science,1933,77:194.

[6] Kozuka S,Tochiku K.Permeability of dormant spores of Bacillus subtilis to malachite green and crystal violet [J].Journal of General Microbiology,1991,137(3):607-610.

[7] 杨健,何永林,刘晔华.微生物教学中常用细菌染色方法的改进[J].川北医学院学报,2003,18(4):165.

[8] 叶生梅,高威.细菌芽胞染色方法改进研究[J].微生物学杂志,2011,31(1):106-109.

[9] 王煜,汪琴,杨海茹,等.荚膜染色纸片的制备和应用[J].微生物学通报,1993,20(4):246-247.

[10] 胡洪杰,王玉,施鲁笛,等.抗酸染色和芽胞染色的改良型滤纸覆盖加热法[J].中国病原生物学杂志,2009,4(1):51-65.

[11] 朱陶,付灿.几种芽孢染色方法的比较与改进[J].井冈山学报:自然科学版,2008(29):49-50.

[12] 袁红,倪有娣,缪利英,等.介绍一种细菌芽孢微波染色法[J].杭州医学高等专科学校学报,2002,23(5/6):236.

[13] 赵世鸿,夏世平,向丽,等.炭疽杆菌芽胞染色法的改进[J].中国误诊学杂志,2004,4(9):1429-1430.

[14] May H G.A safe spore stain for class use [J].Biotechnic & Histochemistry,1926,1(3):105-106.

[15] Hayama M,Oana K,Kozakai T,et al.Proposal of a simplified technique for staining bacterial spores without applying heat successful modification of Moeller’s method [J].European Journal of Medical Research,2007,12(8):356-365.

[16] 侯东军,暴增海.细菌芽孢染色方法的改进研究[J].河北农业技术师范学院学报,1993,7(2):13-15.

[17] 刘晓焱,姚文琴,徐晓青.细菌芽胞两种染色法最佳实验条件观察[J].现代预防医学,2008,35(24):4862-4865.

[18] 宋瑛琳,王芳,田明.细菌芽孢染色方法比较的研究[J].实验室科学,2012,15(1):122-123.

Exploration on a modified dip-staining method for bacterial spores staining

Zheng Dongchao, Fan Jia, Wang Yuhao, Zhang Jie, Zhao Jian,Yang Xin, Wang Hong

(School of Life Sciences,Sichuan University,Chengdu 610065,China)

Continued-heating malachite green dye is usually used in traditional spore staining method to color the spore.This method is difficult to operate and has a low successful rate.Besides,the malachite green dye is poisonous,when being heated it could splash then cause pollutions. This study uses the dip-staining method to improve the traditional spore staining method,and compares the staining effects between different malachite green concentrations and different staining time.The results show that the best staining results could be achieved with 10% malachite green dye,staining 10 minutes.This improved method is easy to operate,the staining effect is obvious, and the structure of mycelium and spore is easier to be distinguished and much more safe and green.

bacteria spore staining; dip-staining method; malachite green

2014- 05- 05

四川大学实验技术项目(2015-103)

郑冬超(1985—),女,河北石家庄,博士,实验师,现主要从事普通生物学实验教学

E-mail：dongchao_zheng@scu.edu.cn.

汪红(1961—),女,四川成都,高级实验师,现主要从事微生物学实验教学.

E-mail：wh002008@163.com

G642.423

B

1002-4956(2015)7- 0191- 02