采后β-氨基丁酸处理对梨果实黑斑病的抑制

董柏余,葛永红,毕 阳,李海杰,龚 迪

(甘肃农业大学食品科学与工程学院,甘肃兰州 730070)

采后β-氨基丁酸处理对梨果实黑斑病的抑制

董柏余,葛永红,毕 阳*,李海杰,龚 迪

(甘肃农业大学食品科学与工程学院,甘肃兰州 730070)

本文研究了采后β-氨基丁酸(BABA)处理对苹果梨损伤接种互隔交链孢(Alternariaalternata)果实病斑扩展以及苯丙烷代谢的影响。结果表明,50μg/mL的BABA可有效抑制损伤接种果实病斑直径的扩展;用BABA浸泡果实10min,以及处理和损伤接种间隔12h的处理效果最佳。果实经BABA处理后,体内的苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性明显提高,总酚和类黄酮含量也显著增加。由此表明,BABA可通过诱导果实体内的苯丙烷代谢来增强对黑斑病的抗性。

梨,互隔交链孢,β-氨基丁酸,采后病害

苹果梨(Pyruspyrifoliacv. Pingguoli)是我国北方寒温带地区的著名水果,但其易遭受互隔交链孢(Alternariaalternata)侵染而发生黑斑病[1]。虽然化学杀菌剂可有效控制黑斑病,但由于其残留危害、病原物产生抗药性,以及环境污染等问题而受到限制[2]。因此,开发新的、更加安全有效的采后病害控制方法显得十分必要[3]。β-氨基丁酸(β-aminobutyric acid,BABA)是一种非蛋白氨基酸[4],具有诱导多种作物的抗病能力[5]。此外,BABA还可诱导苹果对青霉病[6]、马铃薯对干腐病和晚疫病[7-8],以及番茄对晚疫病的抗性[9]。BABA对采后病害的抗性诱导涉及活性氧代谢与病程相关蛋白的积累等方面[10-11],桔和苹果经BABA处理后过氧化物酶(POD)与苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性都有显著提高[12-13]。虽然已经有研究表明BABA可诱导梨对青霉病的抗性[14],但尚未见其对梨黑斑病诱导抗性的报道。

本研究以苹果梨为试材,探索采后BABA不同浓度处理以及不同浸泡时间,不同损伤接种间隔时间对其采后病害的控制效果,并分析处理对果实PAL活性、类黄酮和总酚类含量的影响,为BABA在采后病害控制中的进一步应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

苹果梨 花后100d采自甘肃省景泰县条山农场,单果套发泡网袋后入标准包装箱。隔天运抵农业大学食品科学与工程学院采后生物学与技术实验室,在室温(20±2℃;RH 55%～60%)下贮藏待用;互隔交链孢(A.alternata) 分离自自然发病的苹果梨果实,纯化后用马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基保存,使用前于PDA培养基25℃下活化培养7d;β-氨基丁酸 天津市光复精细化工研究所,分析纯。

UV-2450紫外分光光度计 日本岛津;YXJ-2离心机 湘仪离心机仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 孢子悬浮液的配制 参照刁春英方法[15]。取25℃下培养10d的带菌PDA平皿一个,加入含0.05% Tween80的无菌水约10mL,用玻璃棒刮下PDA平板上的病原菌孢子,然后转入50mL三角瓶中,在WYX-A微型旋涡混合器上振荡15s,再用双层纱布过滤,滤液用血球计数板计数算出孢子悬浮液的浓度,最后稀释至所需浓度(1×106CFU/mL)。

1.2.2 BABA处理浓度筛选 将表面用自来水冲洗干净的果实分别在50、250、500μg/mL的BABA中浸泡10min,取出晾干后在室温下存放,12h后接种A.alternata孢子悬浮液(1×106CFU/mL),入包装箱于常温((20±2)℃;RH 55%～60%)下贮藏待用。以清水处理为对照。每处理用果实15个,重复3次。

1.2.3 浸泡时间筛选 果实在50μg/mL的BABA溶液中分别浸泡5、10、15min,自然风干后在室温下存放,12h后损伤接种A.alternata孢子悬浮液(1×106CFU/mL),并置于((20±2)℃;RH55%～60%)下贮藏待用。

1.2.4 接种时间筛选 果实用50μg/mL BABA溶液处理10min,分别于处理后12、24、48h损伤接种A.alternata孢子悬浮液(1×106CFU/mL),接种后的果实置于室温((20±2)℃;RH 55%～60%)下贮藏待用。

1.2.5 病斑直径测定 选取上述处理的果实定期观察并用十字交叉法测量病斑直径。每处理用果实15个,重复3次。

1.2.6 苯丙烷代谢关键酶活性和产物含量的测定

1.2.6.1 取样 分别于BABA处理后第0、2、4、6、8、10d取皮下2～5mm处果肉组织3g。组织用锡箔纸包好,液氮冷冻,在-80℃超低温冰箱中保存待测。

1.2.6.2 苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的测定 参照Yin等方法[16]并修改。称取3g果肉组织,加入3mL经4℃预冷的、0.2mol/L、pH8.8的硼酸缓冲液(含1% PVPP,1mmol/L EDTA和50mmol/L β-琉基乙醇),在冰浴条件下研磨成匀浆,于4℃、15000×g离心20min,上清液立即用于酶活测定。PAL酶促反应体系包括:2mL,pH8.8的硼酸缓冲液(0.2mol/L),300μL粗酶液和lmL、0.02mol/L的L-苯丙氨酸。24℃下反应2min时,在紫外可见分光光度仪上测其OD290。空白以硼酸缓冲液代替酶液。酶活以每分钟内OD290变化0.01为1个活性单位(U),酶活性以U·mg protein-1表示。实验重复3次。酶提取液中蛋白质含量利用考马斯亮蓝法进行测定。

1.2.6.3 总酚和类黄酮含量的测定 参照Pirie and Mullins[17]的方法并加以修改。取-80℃冷冻的果肉组织3g,加入预冷的1% HCl-甲醇溶液5mL,冰浴下充分研磨成匀浆,将匀浆液移入离心管内置于暗处4℃下放置20min,进行提取。然后在4℃ 10000×g下离心15min,上清液即可用于总酚和类黄酮含量的测定。取上清液分别在280nm(总酚)和325nm(类黄酮)下测定其吸OD 值,总酚含量用ΔOD280/g FW表示;类黄酮含量用ΔOD325/g FW表示。实验重复3次。

1.3 数据处理

部分实验数据用SPSS 19.0软件进行邓肯氏多重差异分析(p<0.05)。用 Excel 2007 软件计算标准偏差并绘制图表。

2 结果与分析

2.1 BABA处理对果实病斑直径的影响

图1 BABA处理对苹果梨果实损伤接种A.alternata病斑直径的影响Fig.1 Effect of BABA treatment on lesion diameter of pear fruit注:A为不同浓度,B为不同浸泡时间,C为不同损伤接种间隔时间;图中竖线表示标准偏差(±SE),同一时间不同字母表示差异显著(p<0.05)。

果实经三种浓度BABA处理后,其中只有50μg/mL处理可显著降低果实损伤接种A.alternata的病斑直径(p<0.05),其病斑直径比对照低20.4%(图1A)。当浸泡时间为10min时处理显著低于对照(p<0.05),病斑直径比对照低15.4%(图1B)。当处理与损伤接种的间隔时间为12h时与对照组相比有显著差异(p<0.05),处理组病斑直径低于对照组18.2%(图1C)。

2.2 BABA处理后果实PAL活性和总酚、类黄酮含量的变化

BABA处理可显著提高果实的PAL活性,处理组与对照组均呈先上升后下降的趋势,处理组在第2d达到最大,高出同期对照54.7%(图2A)。处理组果实总酚含量在第2d时达到最大值随后基本保持平稳的趋势,其中在第2d时高出对照14.7%(图2B)。处理组与对照组类黄酮含量变化趋势与总酚变化趋势类似,其中处理组类黄酮含量在贮藏第2d达到最大值,高出对照组14.1%(图2C)。

图2 50μg/mL BABA处理对苹果梨果实PAL活性、总酚含量和类黄酮含量的影响Fig.2 Effect of BABA at 50μg/mL on activity of PAL and accumulation of phenolics,flavonoidin pear fruit

3 结论与讨论

本研究结果表明,采后50μg/mL BABA处理可通过诱导果实苯丙烷代谢的关键酶活性及产物的积累来提高苹果梨对黑斑病的抗性。这与采后BABA处理可以提高桔[18]与苹果[6,19]的抗病能力的研究结果相类似。PAL是苯丙烷类代谢途径中的第一个关键酶,与植保素、木质素及酚类化合物的形成密切相关,在PAL的作用下,苯丙氨酸脱氨基可以生成酚类和其他具有抗菌活性的物质,它们对抑制病原菌具有明显的作用[20]。本研究发现,BABA处理显著提高了果实的PAL活性(图2A),这与BABA处理后明显提高马铃薯[7]、梨[14]、芒果[16]以及桔[18]PAL活性的结果一致。酚类和类黄酮是苯丙烷代谢的末端产物,具有一定的抗菌作用,酚类化合物被氧化后形成毒性更强的醌类物质,能有效抑制病原物的扩展。此外,酚类物质还是木质素等抗病物质合成的前体[21-23]。类黄酮具有明显抗微生物活性,可抑制孢子萌发、芽管伸长、菌丝生长[24]。本研究结果显示,BABA处理可显著提高果实总酚和类黄酮的含量(图2B,图2C)。这说明BABA处理可明显激活酚类和类黄酮合成途径,加速植保素的合成和木质化的形成进程,以增加果实对病原物抵抗能力。这与BABA处理马铃薯块茎明显提高总酚类物质含量的结果一致[7]。

当BABA浸泡时间为10min时,对A.alternata的抑制效果最佳,而浸泡时间为5min抑制效果不明显,可能是由于浸泡时间过短导致BABA渗入果实组织的浓度不够,没能有效激发果实的抗性(图1B)。另外,本实验还发现在BABA处理后间隔12h损伤接种A.alternata的抑制效果要好于间隔24h和48h(图1C),这可能与BABA诱导的抗性周期相关,说明处理后间隔12h比间隔24h和48h诱导了更强的抗性。但BABA对苹果梨果实的诱导抗性周期如何变化,以及更深入的诱抗机理尚有待进一步研究。

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Effect of the postharvest β-aminobutyric acid treatment on the inhibiton of fruit alternaria rot of pear fruit

DONG Bo-yu,GE Yong-hong,BI Yang*,LI Hai-jie,GONG Di

(College of Food Science and Engineering,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China)

Effect of β-aminobutyric acid(BABA)dipping on lesion development of pear fruit inoculated withAlternariaalternataand potentiation of phenylpropanoid pathway was investigated in this paper. The results indicated that the lesion diameter of pear inoculated withA.alternatawas significantly decreased when BABA at 50μg/mL,and the smallest lesion diameter was determined in the fruit treated for 10min. In addition,the interval of treatment and inoculation also affected lesion development,and with inoculation the fruit 12h after treatment showed the best result. Further studies showed that BABA increased phenylalanine ammonia lyase(PAL)activity,accumulated the total content of phenolic and flavonoids in the fruit during storage. It was suggested that BABA treatment inhibited Alternaria rot of pear by enhancing phenylpropanoid pathway in fruits.

pear;alternariaalternata;β-aminobutyric acid(BABA);postharvest diseases

2014-05-19

董柏余(1986-),男,硕士研究生,研究方向：果蔬采后生物学与技术。

*通讯作者:毕阳(1962-),男,博士,教授,研究方向：果蔬采后生物学与技术。

新型蓄冷保温技术与设备(2013BAD19B01)。

TS255.3

A

1002-0306(2015)07-0320-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.07.058