“二仙汤”对人乳腺癌HCC1937细胞侵袭的影响

顾 渊，石坤和，高 瑛，李 夏，李 宁，唐晓丹，杨新伟，王开强

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，乳腺癌细胞转移是治疗失败和患者死亡的主要原因。中医学认为冲任失调是发生乳房疾病最主要的致病因素之一，也是乳腺癌复发转移的重要病机。临床上“调摄冲任”治则法能明显改善乳腺癌术后患者的预后，减少肿瘤复发和转移。本研究就“二仙汤”经典方剂的抗乳腺癌HCC1937细胞转移进行了体外实验研究。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料及实验动物

细胞HCC1937为人乳腺癌细胞株，购自中国科学院细胞库。SD雌性大鼠，购自中国科学院实验动物处。

1.2 仪器设备

CO2培养箱，RTCA×CELLigence DP系统，CIM Plate 16检测板，垂直电泳槽购自biorad生物公司;垂直电转移槽购自biorad生物公司。

1.3 药物及试剂

“二仙汤”的配方:由仙灵脾、仙茅、巴戟天、当归、黄柏、知母、莪术组成，由上海市中医医院中药房提供，并制成含生药量6 g的流浸膏。5-氟尿嘧啶(5-FU)医药股份有限公司生产，蒸馏水配制成15 mg/ml。RPMI1640购自凯基生物公司，FBS购自Gibico生物公司，1%Penicilline-Streptomycin solution购自Gibico生物公司，0.25%/Trypsin/EDTA solution购自Gibico生物公司，PBS购自Hyclone生物公司，蛋白提取试剂盒购自凯基生物公司，BCA蛋白定量试剂盒购自凯基生物公司。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞培养 10%优质胎牛血清，在37℃和5%CO2充分湿化条件下培养备用。参照文献［1］。

1.4.2 动物分组及药物血清制备 SD雌性大鼠60只，分为“二仙汤”治疗组、5-FU组、空白对照组，每组20只。大鼠给药剂量为人等效剂量的5倍，即“二仙汤”31 g/(kg·d)(生药量)，5-FU 100 mg/(kg·d)。“二仙汤”治疗组按10 ml/kg确定灌胃剂量，早晚各灌胃1次;5-FU组按腹腔注射给药，早晚各1次;空白对照组以等体积生理盐水灌饲。连续给药3 d后，当夜禁食不禁水，第4天再给药1次(1 d量)。二仙汤治疗组和空白对照组在末次给药后1.5～2 h腹主动脉采血，5-FU组末次给药后6 min腹主动脉采血。无菌条件下分离血清，同组混合以消除个体差异，45 μm微孔滤膜过滤除菌，56℃，30 min水浴灭活，－80℃保存备用。

1.4.3 “二仙汤”药物血清对体外细胞侵袭能力的影响 (1)在超净台内将检测板上室与下室从包装中取出，放在超净台上，使蓝色标志点位于夹具的左上方，将下室平稳地放到夹具对应的凹槽中。(2)下室的孔中加入165 μl培养基，注意加液时不要产生气泡，使加入的培养基在下室的孔内形成凸出的弯月面。(3)将夹具连同下室沿逆时针旋转90°，将上室中传感器一面置于下室上，注意使上室与下室的孔对齐。放置时注意上、下室贴有蓝点的孔相对应，放置时要避免气泡的产生。将上室放到下室上之后，立即用手向下按压，可听到2次卡扣卡入的声音。(4)在上室中加入30 μl无血清培养基，轻拍板的四周，使培养基分布均匀。置于37℃，CO2浓度为5%的培养箱中平衡1 h。(5)制备细胞悬液:细胞株在进行细胞迁移实验前一天进行细胞传代，使细胞饱满度在60% ～80%之间。从培养箱中取出细胞，消化离心后，用无血清培养基配制成实验需要的细胞浓度为7×105个/ml。(6)将测好基线的板取出，在上室孔中加入100 μl混合均匀的无血清细胞悬液，使每孔中细胞数为70 000个。然后将板置于超净台中室温放置30 min后，进行检测。

1.5 统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件，组间数据比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

“二仙汤”治疗组与5-FU组、空白组生理盐水组相比均有抑制HCC1937细胞体外侵袭的作用(P＜0.05)，其中以“二仙汤”治疗组作用最为显著，5-FU组无作用。见图1。

图1 各药物血清对体外人乳腺癌HCC1937细胞侵袭的影响

3 讨论

乳腺癌的复发转移是治疗失败的主要标志，也是导致患者死亡的主要原因。存在于癌细胞内部Cdc42蛋白是癌细胞转移所需的关键蛋白，是癌细胞内皮细胞相互作用和跨内皮细胞迁移的关键调节者［2］。研究人员发现，这种蛋白能够帮助癌细胞依附于血管壁上，从而使它们通过血液扩散到身体的其他部位。Cdc42蛋白基因在调节细胞骨架、细胞运动、细胞凋亡、细胞恶性转化及肿瘤细胞的浸润、转移等方面发挥重要作用［3］。抑制Cdc42蛋白，癌细胞便无法再依附于血管内壁的内皮细胞上，从而减少其扩散的机会。以Cdc42蛋白为抑制靶点，或将成为预防癌症转移的有效方法。

中医学认为，乳房的生理、病理直接受冲任二脉经气盈亏的调节。冲任失调是乳腺癌复发转移的重要因素。“二仙汤”是调摄冲任的经典代表方，由仙灵脾、仙茅、巴戟天、当归、黄柏、知母、莪术组成。方中灵脾、仙茅、巴戟天能温肾助阳、充盈冲任;当归、黄柏、知母、莪术能疏肝活血以调冲任。该方可从根本上调整体内阴阳平衡。动物实验表明，以“二仙汤”为基本方的乳宁方对DMBA诱导的大鼠乳腺癌模型无论是启动期还是促癌期均有抑制作用［4］。临床应用研究发现以“二仙汤”为基础的中药方剂对乳腺癌术后复发转移有明显的抑制作用，能提高患者无瘤生存和远期存活率［5］。

本实验表明以调节冲任失调的代表方剂“二仙汤”能改善乳腺癌患者的预后，抑制乳腺癌的复发转移。但“二仙汤”究竟是如何影响抑制乳腺癌细胞的转移，具体机制还有待进一步的研究。

［1］ Ding J，Huang S，Wu S，et al.Gain of miR-151 on chromosome 8q24.3 facilitates tumour cell migration and spreading through downregulating RhoGDIA［J］.Nat Cell Biol，2010，12:390-399.

［2］ Reymond N，Im JH，Garg R，et al.Cdc42 promotes transendothelial migration of cancer cells through beta1 integrin［J］.J Cell Biol，2012，199(4):653-668.

［3］ Emeline C，Florent P，Sanson M.N-cadherin expression level modulates integrin-mediated polarity and strongly impacts on the speedand directionality of glial cell migration［J］.J Cell Sci，2011，125(4):844-857.

［4］ 薛晓红，刘胜，杨新伟，等.乳宁冲剂及拆方对裸鼠移植瘤生长及肺转移的影响［J］.上海中医药杂志，2005，39(7):45-47.

［5］ 陈光群，黄振步，黄志有.乳复宁2号治疗乳腺癌Ⅱ-Ⅲ期术后复发转移的临床研［J］.浙江中医药大学学报，2009，33(3):334-335.