雪莲果叶黄酮的纯化工艺

陈红惠，刘芳，沈清清

（1.云南文山学院化工学院，云南文山663000；2.云南文山学院环境与资源学院，云南文山663000）

雪莲果（Smallanthus sonchifolius，俗名 yacon）又称雪莲薯、亚贡，为菊科多年生草本植物[1]。雪莲果作为含有丰富低聚果糖和酚酸成分的低热量食品，具有调节肠道功能、降血脂、减肥、抗氧化等功效[2-3]，深受消费者青睐，但雪莲果叶中含有的酚酸、黄酮类、萜类等大量活性成分却没有得到重视和开发。Valentová等的试验证实雪莲果叶提取物含有原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、槲皮素等成分[4]，有较强的抗氧化能力，可预防动脉硬化。研究表明，雪莲果叶中具有明显降血糖功效的成分主要与黄酮类化合物有关[5-8]。

黄酮类物质具有抗氧化、抗肿瘤、降血脂等特殊生理功效，近年来对生物资源中的黄酮利用成为了研究热点，国内外学者对许多生物资源的黄酮成分的提取及应用都进行了大量研究[9-17]，目前对于雪莲果叶黄酮纯化的研究还鲜见报道。在常见的纯化方法中，大孔树脂对于多酚类、黄酮类、生物碱类等活性物质具有较强吸附能力，具有分离效果好，吸附速度快，解吸率高，使用方便、成本低廉等优点[12，14，18]，成为现今天然产物成分的主要分离方法之一。本试验通过对9种树脂进行静态吸附和解吸试验优选出适合雪莲果叶黄酮纯化的大孔树脂，确定了雪莲果叶黄酮利用大孔树脂吸附的动态吸附和解吸工艺条件，旨在为雪莲果叶黄酮工业化分离纯化及其综合利用提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

雪莲果叶采自云南丽江，置60℃烘箱中干燥，粉碎过65目筛后备用。

芦丁标准品：Sigma公司；NaNO2、Al（NO3）3、NaOH、95%乙醇、甲醇、丙酮均为国产分析纯；HPD-100、HPD-450、HPD-722、HPD-300、HPD-5000、HPD-600、AB-8、ADS-17、NKA-9型大孔吸附树脂均购自沧州宝恩化工有限公司。

722型紫外-可见光分光光度计：上海光学仪器进出口有限公司；8002型电子恒温水浴锅：上海予康科教仪器厂；EYELA N-1000型旋转蒸发仪：日本东京理化；SHB-HIA型循环水式多用真空泵：河南省太康教材仪器厂；PB-10型pH计：德国Sartorius公司；恒温水浴振荡器：上海百兴仪器设备有限公司；玻璃层析柱（Φ2 cm×30 cm）。

1.2 方法

1.2.1 供试液的制备

称取一定量雪莲果叶干粉，用40%乙醇溶液，料液比为1∶30（g/mL），70℃下提取2次，每次 1 h，真空浓缩后得到雪莲果叶粗提液即吸附样品液。

1.2.2 样品黄酮含量的测定

采用NaNO2-Al（NO3）3比色法进行测定。通过绘制标准曲线，得回归方程：Y=1.375 9X-0.005 6，相关系数R2=0.999 6。将雪莲果叶提取液过滤并定容，从中精确吸取1.00 mL，然后进行显色反应，测定其吸光值，由回归方程可计算出黄酮提取量。

1.2.3 大孔树脂对雪莲果叶黄酮的静态吸附试验

1.2.3.1 不同大孔树脂对雪莲果叶黄酮的静态吸附和解吸试验

分别称取已预处理好的HPD-450、HPD-100、HPD-722、HPD-300、HPD-5000、HPD-600、AB-8、NKA-9、ADS-17型9种大孔吸附树脂各5 g，置于250 mL具塞锥形瓶中，各精密加入50 mL雪莲果叶粗提液，置恒温水浴振荡器上在温度为25℃，振荡频率为120 r/min条件下静态吸附24 h。收集吸附后样液，用蒸馏水将树脂表面黄酮洗净，抽滤至干然后再将树脂放入250 mL具塞锥形瓶中，精密加入50 mL 50%乙醇振荡解吸24 h，收集解吸液，分别测定以上各溶液中黄酮的含量，计算各树脂的饱和吸附量、吸附率及解吸率。

式中：C0、C1分别为吸附前后供试液的黄酮浓度，mg/mL；C2为解吸液中黄酮浓度，mg/mL；V为供试液体积，mL；m 为树脂湿重，g；a为树脂含水量，%。

1.2.3.2 静态动力学试验

根据不同树脂吸附量和解吸率的结果比较，选择HPD-100、HPD-300两种较理想的树脂进行吸附考察其吸附速率。称取该两种预处理好的树脂各5 g装入具塞锥形瓶中，精密加入一定浓度的雪莲果叶粗提液50 mL，置恒温水浴振荡器上于25℃静态吸附，在4h内，间隔半小时从中各取1.0 mL吸附液测定其黄酮含量，绘制静态吸附动力学曲线。

1.2.3.3 静态热力学试验

分别称取5g HPD-100树脂6份，精密加入不同浓度的雪莲果叶粗提液50 mL，置恒温水浴振荡器上于25℃静态吸附24 h，过滤，测定其吸附后样液的黄酮含量，计算吸附量，绘制吸附等温线。

2 结果与分析

2.1 树脂的筛选

要选择合适的树脂吸附有效成分，首选要考虑树脂与有效成分的极性情况、树脂的比表面积、平均孔径等性能参数，最终根据其对该物质的吸附能力和易洗脱能力来评价。考察9种不同型号的树脂对雪莲果叶黄酮的吸附选择性，经静态吸附和解吸后，得到不同树脂的静态吸附量、吸附率和解吸率，结果如表1所示。

表1 9种树脂静态吸附与解吸性能情况Table 1 The performance of static adsorption and desorption with nine macroporous resin

从表1可以看出中极性的树脂对于雪莲果叶黄酮的吸附效果均较低，如ADS-17吸附率仅为18.97%，相对来说弱极性和非极性的树脂对雪莲果叶黄酮的吸附率和解吸率有很大提高，其中以HPD100和HPD300吸附效果较突出，虽然HPD300的吸附率最高，但是解吸率不如HPD100，综合考虑有效成分分离效率情况，选择HPD100用作纯化雪莲果叶黄酮树脂。

2.2 树脂静态吸附动力学特性测定

在以上饱和吸附基础上，考察HPD100和HPD300两种树脂的吸附动力学过程，通过各树脂饱和吸附量反映树脂吸附性能差异，动力学曲线如图1所示。

从图1可以看出，这两种树脂对雪莲果叶黄酮的吸附均为快速吸附平衡型，在1 h内吸附速率急剧增加，而后趋于稳定，在4 h内能达到吸附饱和。在动力学曲线中HPD-300的吸附量略高于HPD-100，但结合表1中两种树脂的静态解吸率情况，选择HPD-100树脂是较合理的。

图1 HPD-100、HPD-300树脂的静态吸附动力学曲线Fig.1 Static adsorption kinetic curves of HPD-100 and HPD-300 macroporous resins towards Yacon leaves flavonoids

2.3 树脂静态吸附热力学特性测定

研究25℃时HPD-100树脂在不同雪莲果叶黄酮提取液浓度下吸附，以浓度为横坐标，吸附量为纵坐标，绘制吸附等温线如图2所示。

图2 吸附等温线Fig.2 Adsorption isotherm curves of HPD-100 resins

由图2可看出，树脂吸附量随着样液浓度的增加而提高，当达到一定浓度时吸附量能达到吸附平衡。

2.4 HPD-100树脂对黄酮吸附条件的选择

2.4.1 料液pH对吸附量的影响

由于黄酮类化合物含有酚羟基结构，故调节溶液酸碱性可改变黄酮在溶液中存在形式，影响与树脂的分子间作用力，从而影响其吸附情况。取预处理好的HPD-100树脂5.0 g，装入层析柱中，湿法装柱。取浓度为0.941 mg/mL的雪莲果叶黄酮粗提液6份，分别调 pH 为 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，以 1.0 mL/min 的速率上样100 mL，考察上样液pH树脂对雪莲果叶黄酮吸附的影响，结果如图3所示。

图3 pH对吸附量的影响Fig.3 Effects of pH on adsorption capacity

由图3可看出，上样液pH在2～7范围内吸附量呈现下降趋势，pH为2时，HPD-100树脂对雪莲果叶黄酮的吸附量是最高的，达到51.74 mg/g，当pH为6时吸附量为23.59 mg/g，出现大幅下降，可能是由于黄酮结构中含有大量-OH，在溶液中以离子形式存在，当溶液在酸性条件下可以使黄酮以分子状态存在，可以增加与树脂间的范德华力作用，有利于被树脂吸附，从而提高其吸附量。但酸性过强，黄酮类化合物易生成烊盐，相反使吸附效果变差，而pH增大至碱性，则使-OH解离形成H+，与树脂的结合减弱从而吸附量降低。结合试验结果，确定上样液适宜pH为2。

2.4.2 上样浓度对吸附量的影响

调节雪莲果叶黄酮粗提液初始浓度分别为0.732、0.939、1.249、1.366、1.796、2.211 mg/mL，调 pH 为 2.0，以1.0 mL/min上样速率上样100 mL，考察上样液浓度对树脂吸附雪莲果叶黄酮的影响，结果如图4所示。

图4 上样浓度对树脂吸附的影响Fig.4 Effects of different concentration on absorption of HPD-100 resins

由图4可看出，不同质量浓度的上样液对树脂的吸附量有明显影响，随着黄酮浓度的提高吸附量也随之增加，当上样液浓度增加到1.806 mg/mL时吸附量达到最高，为59.69 mg/g，当继续增加上样液质量浓度后吸附量出现逐渐降低，这是由于在上样液质量浓度较低时溶液杂质较少，树脂显示良好吸附性能，吸附量表现出随上样质量浓度增加而增加的趋势，但质量浓度越高吸附量增加越少，直至吸附饱和，当上样液质量浓度过大溶液易浑浊，杂质含量也较多，则使树脂堵塞造成污染，大大降低树脂的吸附能力，从而出现吸附量下降的情况，综合考虑雪莲果叶黄酮吸附液的质量浓度为1.806 mg/mL左右为宜。

2.4.3 上柱流速对吸附量的影响

上样液通过树脂床的流速快慢对目标成分的吸附量及工作效率有较大影响。取预处理好的HPD-100树脂5 g上柱，将浓度为0.175 mg/mL的雪莲果叶黄酮粗提液在pH2.0条件下，分别以0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mL/min的上样速率进入树脂柱中进行吸附实验，当流出液吸光值达到上样液的1/10时，认为黄酮已经透过，停止上样，测定流出液黄酮含量，考察不同上样流速对树脂吸附量的影响，结果如图5所示。

图5 上样流速对吸附量的影响Fig.5 Effects of moving speed on adsorption capacity

由图5可看出，流速为0.5 mL/min时吸附量最大，随着流速增加吸附量逐渐下降。这是由于上样液流速不同会影响树脂与目标成分的接触时间，流速过快则黄酮物质没有扩散至树脂内表面就流出，导致泄露点提前，流速减慢能使黄酮物质充分接触，有利于提高吸附效果，但过小的流速会使生产周期延长。综合以上考虑，上样液流速以1.0 mL/min较为适宜。

2.5 HPD-100树脂洗脱条件对洗脱效果的影响

2.5.1 解吸剂种类的选择

洗脱剂的选择应根据相似相溶原理，对非极性和弱极性大孔树脂，洗脱剂极性越小，洗脱能力则越强；对中等极性大孔树脂和极性较大的化合物，应选用极性较大的溶剂较合适。称取5 g已吸附饱和的HPD-100树脂4份，分别加入相同浓度（60%）的甲醇、乙醇、丙酮和水溶液作为解吸剂，置恒温水浴振荡器上于25℃静态解吸4 h，测定解吸液的黄酮含量，考察不同溶剂对雪莲果叶黄酮的洗脱效果影响，结果如图6所示。

图6 不同解吸剂对解吸率的影响Fig.6 Effects of different desorption agent on desorption rate

由图6可看出，有机溶剂的洗脱效果远好于水溶液，其中丙酮的洗脱效果最好，静态解吸率可达93.48%，甲醇和乙醇的洗脱率分别为78.45%和89.25%，而水的洗脱效果最差，洗脱率只有8.09%。由于丙酮的毒性较大，尽管解吸率最高，但考虑到安全性，故应选择成本较低，解吸效果也较好的乙醇作为解吸剂。另外水作为解吸剂来说虽然解吸率很低，但是用水冲洗饱和吸附后树脂中的杂质时也要适量，否则会使已吸附的黄酮物质被冲洗下来造成损失。

2.5.2 不同体积分数乙醇对洗脱效果的影响

取5 g饱和吸附的HPD-100树脂上柱，用蒸馏水冲洗干净杂质后，分别用体积浓度为30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇溶液洗脱，控制洗脱速率1 mL/min对树脂进行解吸，测定洗脱液中黄酮的含量，考察不同乙醇浓度对雪莲果叶黄酮洗脱效果的影响，结果如图7所示。

图7 洗脱剂体积分数对解吸率的影响Fig.7 Effect of ethanol concentration on adsorption quantity of Yacon leaves flavonoids

由图7可以看出，以不同体积分数的乙醇作为洗脱剂得到的解吸效果出现先增加后下降的趋势，当乙醇体积分数为60%时解吸率最高，达到92.75%，这是由于乙醇体积分数较低时，黄酮物质与树脂结合力较强，不能将其洗脱下来，洗脱液中水溶性杂质较多，而增加乙醇体积分数，洗脱液中醇溶性杂质增加，洗脱率反而下降，洗脱液中黄酮纯度也降低，故选择体积分数为60%的乙醇溶液作为洗脱剂。

2.5.3 洗脱流速的确定

取5 g饱和吸附的HPD-100树脂，用蒸馏水冲洗干净杂质后，用60 mL 60%乙醇溶液分别在0.5、1.0、1.5、2.0 mL/min流速下洗脱，收集洗脱液，测定洗脱液的黄酮含量，考察洗脱流速对雪莲果叶黄酮洗脱效果的影响，结果如图8所示。

由图8可看出，洗脱剂流速对洗脱效果有明显影响，解吸率随洗脱剂流速增加呈下降趋势，当流速为0.5 mL/min时解吸率最高，达到96.56%，而流速为2 mL/min时，解吸率只有75.24%。这是由于流速加快致使洗脱剂未能与树脂充分作用，则洗脱出来的黄酮物质较少，而流速减慢能进行充分洗脱，故解吸效率较高，但生产效率低，综合考虑以上因素，洗脱剂的流速宜控制在1 mL/min为宜。

图8 洗脱剂流速对洗脱效果的影响Fig.8 Effects of moving speed of desorption agent on desorption rate

2.5.4 洗脱剂最大洗脱体积的确定

称取5 g HPD-100树脂，湿法上柱，将已知浓度的雪莲果叶黄酮提取液以1 mL/min的速度进样，每隔10 min收集吸附液，直至达到泄露点，吸附饱和后，用少量水洗去树脂表面的杂质，再用体积分数为60%的乙醇洗脱，洗脱流速为1 mL/min，分部收集洗脱液，紫外观察黄酮的洗脱情况，直到无黄酮洗脱出来为至，由此获得洗脱液的最大洗脱体积，同时绘制黄酮解吸率随洗脱剂体积变化的动态洗脱曲线，结果如图9所示。

图9 HPD-100树脂动态洗脱曲线Fig.9 Dynamic desorption curve of HPD-100 resins

由图9可以看出，用70%乙醇对HPD-100树脂中的黄酮进行洗脱效果好，洗脱峰集中，无拖尾，黄酮物质集中在10 mL～35 mL体积范围内被解吸下来，洗脱体积达20 mL时黄酮的浓度达到最大值，之后解吸率开始出现下降，当洗脱液最大洗脱体积达114 mL使能将吸附的黄酮基本洗脱完全，解吸率达96.56%，洗脱液用量少，解吸效果好。

3 结论

本试验通过静态吸附试验从9种大孔树脂中筛选出HPD-100型树脂为雪莲果叶黄酮纯化树脂，并对影响树脂动态吸附和解吸的各因素进行了优化，确定了HPD-100型树脂纯化雪莲果叶黄酮的工艺条件为：将上样液黄酮在质量浓度为1.806 mg/mL，pH为2.0，上柱流速1 mL/min条件下进行吸附，用60%乙醇溶液以1 mL/min流速洗脱，洗脱体积为114 mL，解吸率为96.56%，雪莲果叶中黄酮纯度可由18.50%提高到56.24%。该工艺操作简便，纯化效果明显，得率高，可为雪莲果叶黄酮的后续研究及应用提供一定技术参考。

[1] Graefe S,Hermann M,Manrique I,et al.Effects of post-harvest treatments on the carbohydrate composition of yacon rootsin the Peruvian Andes[J].Field Crops Research,2004,86(3):157-165

[2] 金文闻,余龙江,孟思进,等.亚贡的植物学及其药理作用研究概况[J].中草药,2006,37(4):633-636

[3] 马挺军,吕飞杰,台建详,等.亚贡叶中营养成分和功能性化学成分分析[J].植物资源与环境学报,2004,13(1):56-57

[4] Valentova K,Moncion A,de Waziers I,et al.The effect of Smallanthus sonchifolius leaf extracts on rat hepatic metabolism[J].Cell Biology and Toxicology,2004,20(2):109-120

[5] Makiko Takenaka,Hiroshi Ono.Novel octulosonic acid derivatives in the composite Smallanthus sonchifolius[J].Tetrahedron Letters,2003,44(5):999-1002

[6] Adam M,Juklova M,Bajer T,et al.Ventura.Comparison of three different solid-phase microextraction fibres for analysis of essential oils in yacon(Smallanthus sonchifolius)leaves[J].Chromatography A,2005,1084(4):2-6

[7] Manuel J,Alicia N,Alfredo Grau,et al.Hypoglycemic effect of the water extract of Smallantus sonchifolius(yacon)leaves in normal and diabetic rats[J].Ethnophar-macology,2001,74(6):125-132

[8] Susana B,Wilfredo M,Alfredo Grau,et al.Sanchez.Subchronic 4-month oral toxicity study of dried Smallanthus sonchifolius(yacon)roots as a diet supplement in rats[J].Food and Chemical Toxicology,2005,43(1):1657-1665

[9] 程东岩,王隶书,范艳君,等.刺玫果总黄酮纯化工艺研究[J].时珍国医国药,2011,22(3):664-665

[10]黄金龙,殷之武,何新华,等.银杏叶总黄酮纯化工艺研究[J].中草药,2012,43(5):922-925

[11]焦岩,王振宇.大孔树脂纯化大果沙棘果渣总黄酮的工艺研究[J].食品科学,2010,31(16):16-20

[12]张立华,张元湖,安春艳,等.石榴皮提取物的大孔树脂纯化及其抗氧化性能[J].农业工程学报,2009,25(1):142-147

[13]朱宇旌,张勇,任慧玲,等.苜蓿异黄酮纯化工艺研究[J].食品工业科技,2008,29(2):182-186

[14]刘高波.沙棘黄酮提取工艺及抗氧化性能的研究[D].哈尔滨:黑龙江大学:2007

[15]董江涛.柿叶黄酮的提取、纯化及抗氧化性研究[D].上海:上海海洋大学:2010

[16]刘兰英,曹有龙,赵友谊.枸杞叶黄酮纯化工艺研究[J].食品科技,2009,34(8):134-137

[17]王雯,沈勇根,上官新晨,等.化橘红总黄酮纯化的工艺研究[J].食品工业科技,2013,34(7):229-234

[18]于荣,廖晓峰.NKA大孔树脂分离纯化栀子中的熊果酸[J].食品研究与开发,2007,28(9):67-71