不同澄清剂对苹果酒的影响

吴明霞，刘瑞芳，方小淋

（宁德师范学院生物系，福建宁德352100）

苹果酒以苹果为原料发酵而成[1]，含大量营养成分，口味柔和，是一种老少皆宜的饮品，成为苹果深加工产业中的宠儿。利用苹果生产出不同口味、不同系列的苹果酒，从外观、营养、稳定性方面符合消费者选择度，满足不同消费群体的需求，成为今后几年我国果酒开发的主要方向。

我国大规模生产苹果酒起步较晚，正处于发展阶级，技术水平与发达国家成熟的酿造行业相比相对薄弱，存在一些急待解决的问题。其中澄清处理直接关系到苹果酒的稳定性和贮存时间，也很大程度上影响苹果酒的品质风味，如何获得理想的澄清效果又不减少其营养成分是影响苹果酒发展的一个重要问题，需不断进行探索研究。

采用壳聚糖、皂土、蛋清、果胶酶四种不同单一澄清剂及复合澄清剂处理苹果酒，确定最佳澄清剂添加量，并对其理化指标进行检测，以期获得合适的澄清剂和维持苹果酒澄清稳定性的方法。

1 材料和方法

1.1 材料

壳聚糖：青岛潜光生物工程有限公司；皂土：齐齐哈尔台龙食品有限公司；果胶酶：天津市利华酶制剂厂；安琪酵母：安琪酵母股份有限公司；VC：大同市云岗制药有限公司；考马斯亮蓝G250：上海化学试剂站分装厂。

1.2 仪器

T6新世纪紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；GR60DA高压灭菌锅：致微（厦门）仪器有限公司；PK-DB电热恒温水槽：上海精宏实验设备有限公司；L550台式低速离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；JYZ-B550九阳榨汁机。

1.3 方法

1.3.1 苹果酒制作工艺流程

1.3.2 澄清剂的配制

1%壳聚糖：称取1 g柠檬酸，加入98 mL蒸馏水加热溶解，再加入1 g壳聚糖，搅拌溶解，配成1%壳聚糖溶液，冷却备用[2]。

1%皂土：称取1 g皂土，加入100 mL蒸馏水浸泡24 h，搅拌均匀，皂土吸水膨胀后形成胶体悬浮液备用[3]。

20%蛋清液：取一新鲜鸡蛋的蛋清20 mL，加1 g NaCl后用蒸馏水调匀，定容至100 mL，备用。

1%果胶酶：称取1 g果胶酶，先用50 mL 40℃温水溶解后，再加入到50 mL温水中稀释，摇匀搅拌，配制成1%的果胶酶溶液，放置1 h～2 h后备用[4]。

1.3.3 单一澄清剂的澄清试验

1.3.3.1 壳聚糖的澄清试验

取苹果原酒20mL5份于小烧杯中，分别加入1%、2%、3%、4%、5%（体积分数）配制好的1%壳聚糖溶液，充分搅拌，用保鲜膜封口，在冷处理（0℃）和非冷处理（20℃）条件下静置24 h后，取其上清液离心（4 000 r/min，15 min），以蒸馏水为空白，不添加任何澄清剂的苹果酒为对照，测定透光率和吸光值。

1.3.3.2 皂土的澄清试验

取苹果原酒20 mL 5份于小烧杯中，分别加入2%、4%、6%、8%、10%（体积分数）配制好的1%皂土溶液，充分搅拌，用保鲜膜封口，在冷处理（0℃）和非冷处理（20℃）条件下静置24 h后，取其上清液离心（4 000 r/min，15 min），以蒸馏水为空白，不添加任何澄清剂的苹果酒为对照，测定透光率和吸光值。

1.3.3.3 蛋清的澄清试验

取苹果原酒20 mL 5份于小烧杯中，分别加入0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%（体积分数）配制好的蛋清液，充分搅拌，用保鲜膜封口，在冷处理（0℃）和非冷处理（20℃）条件下静置24 h后，取其上清液离心（4 000 r/min，15 min），以蒸馏水为空白，不添加任何澄清剂的苹果酒为对照，测定透光率和吸光值。

1.3.3.4 果胶酶的澄清试验

取苹果原酒20mL5份于小烧杯中，分别加入1%、2%、3%、4%、5%（体积分数）配制好的1%果胶酶溶液，充分搅拌，用保鲜膜封口，在冷处理（0℃）和非冷处理（20℃）条件下静置24 h后，取其上清液离心（4 000 r/min，15 min），以蒸馏水为空白，不添加任何澄清剂的苹果酒为对照，测定透光率和吸光值。

1.3.4 复合澄清剂的澄清试验

在以上单因素试验基础上，选取澄清效果较好的3种澄清剂进行两两复合，按相同比例添加量，对苹果酒进行复合澄清处理，以冷处理和非冷处理条件下澄清后的苹果酒透光率为检测指标。

1.3.5 苹果酒非生物稳定性试验

1.3.5.1 蛋白质稳定性试验[5]

1.3.5.2 酒石酸氢钾稳定性试验[5]

1.3.5.3 铁稳定性试验[5]

1.3.5.4 铜稳定性试验[5]

1.3.5.5 氧化稳定性试验[5]

1.3.6 理化指标的检测方法

1.3.6.1 透光率T

采用分光光度计法，以蒸馏水作空白，取澄清分离后的酒液，在波长720 nm的光波处测定透光率T[6]。

1.3.6.2 吸光度A

采用分光光度计法，以蒸馏水作空白，取澄清分离后的酒液，在波长450 nm的光波处测定吸光度A[7]。

1.3.6.3 蛋白质含量

考马斯亮兰G250法[8-9]。

1.3.6.4 总酚含量

福林-肖卡法[10]。

1.3.6.5 酒精度

酒精计法[11]。

1.3.6.6 残糖量

斐林试剂滴定法[12]。

1.3.6.7 总酸

酸碱中和滴定法[13]。

2 结果与分析

2.1 单一澄清剂对苹果酒澄清效果的影响

2.1.1 壳聚糖对苹果酒的澄清效果

壳聚糖对苹果酒的澄清效果见图1、图2。

图1 壳聚糖添加量对透光率的影响Fig.1 The content of chitosan effect on light transmittance

图2 壳聚糖添加量对吸光值的影响Fig.2 The content of chitosan effect on the absorbance values

由图1可知，在冷处理和非冷处理条件下，随着壳聚糖添加量的增加，苹果酒透光率的变化趋势都是先增加后下降。当常温添加量达4%时，澄清效果最好，透光率高达99.79%；当添加量小于等于3%时，冷处理的效果比非冷处理的效果好。这是因为壳聚糖在酸性酒液中形成正电荷分子，与酒中带负电荷的蛋白质、果胶等微粒相互作用，使引起酒液混浊的胶形颗粒絮凝沉淀下来。若再增加用量，过量的壳聚糖部分溶解于酒中，带入新的浑浊，再加上其本身凝胶作用，反而使透光率下降。由图2中可知，加入壳聚糖澄清剂后，苹果酒的吸光度明显降低，说明壳聚糖吸附了酒中的色素，使得酒液色泽变浅。添加量高达5%时吸光值的增高，也许是过量的壳聚糖使酒液返浑引起的。因此，壳聚糖最佳添加量为冷处理3%。

2.1.2 皂土对苹果酒的澄清效果

皂土对苹果酒的澄清效果见图3、图4。

图3 皂土添加量对透光率的影响Fig.3 The content of bentonite effect on light transmittance

图4 皂土添加量对吸光值的影响Fig.4 The content of bentonite effect on the absorbance values

由图3可知，皂土能使苹果原酒透光率增大，同时冷处理比未冷处理的透光率高。常温处理时，皂土添加量为8%时透光率最高为98.99%；但随着添加量的增加，透光率下降，可能是因为酒中的蛋白质被皂土沉淀完全，过量的皂土悬浮液本身会引起酒的浑浊。冷处理时，透光率随添加量增加也缓慢提高，当添加量达到6%时，透光率最高为99.32%。这可能是苹果酒里含有的蛋白质比较多，皂土悬浮液中带负电荷的胶体细粒和酒中带正电荷的蛋白质等物质相互作用，产生絮凝沉淀，从而达到澄清目的。由图4可知，和原酒相比，皂土澄清后的苹果酒吸光值明显下降，表明皂土还可以吸收苹果酒中的色素。因此，皂土最佳添加量为冷处理的6%。

2.1.3 蛋清对苹果酒的澄清效果

蛋清对苹果酒的澄清效果见图5、图6。

图5 蛋清液添加量对透光率的影响Fig.5 The content of egg white effect on light transmittance

图6 蛋清液添加量对吸光值的影响Fig.6 The content of egg white effect on the absorbance values

由图5可知，蛋清冷处理的澄清效果明显优于未冷处理，透光率都在97.5%以上。冷处理中，在添加量为2%时，蛋清溶液透光率升至98.92%，比原酒透光率提高3.89%，而未冷处理时，最佳蛋清添加量为1.5%，透光率97.01%，这可能是因为冷处理使发酵后酒中残留的蛋白质、死酵母、果胶等物质加速沉淀使透光率升高，同时能与苹果酒中的酚类物质结合，吸附酒中混浊微粒使其成为小片状物而被除去，因而透光率增高。当添加量再增大，透光率有下降的趋势，原因可能是吸附达到饱和状态后，酒液中游离清蛋白增加影响透光率。由图6可知，冷处理的吸光值比未冷处理的吸光值低，说明冷处理有利于色素析出，能够改善酒体的色泽。因而，蛋清液的最佳添加量为冷处理的2%。

2.1.4 果胶酶的澄清效果

果胶酶对苹果酒的澄清效果见图7、图8。

图7 果胶酶添加量对透光率的影响Fig.7 The content of pectinase effect on light transmittance

图8 果胶酶添加量对吸光值的影响Fig.8 The content of pectinase effect on the absorbance values

由图7可知，用果胶酶处理的苹果酒，澄清效果不理想，最高的透光率才97.89%。当果胶酶添加量为2%时，冷处理和常温处理的透光率都达到最高值。果胶酶添加量小于等于2%时，果酒透光率迅速提高，原因可能是果胶酶能使不溶性大分子物质和果肉微粒失去胶体保护作用而发生共聚沉淀，达到澄清目的。但当添加量大于2%时，透光率开始下降，也许是果胶降解所得的低分子物质改变了酒的pH，从而影响果胶酶的效用。由图8可知，冷处理的吸光度明显小于未冷处理吸光度，说明冷处理的果胶酶可以吸附酒中的色素，使得酒的色泽相对变浅。因此果胶酶添加量2%为最适添加量。

2.1.5 单一澄清剂的比较

4种单一澄清剂对苹果酒的澄清效果见图9。

图9 4种单一澄清剂对透光率的影响Fig.9 Four single clarifying agent's influence on light transmittance

由图9可知，4种澄清剂都一定程度地提高了苹果酒的透光率，其中壳聚糖的澄清效果最好，皂土次之，果胶酶最差。从成本上考虑，壳聚糖虽然澄清效果很好，但是成本高；皂土价格便宜，但是配制麻烦。因此可以选择效果好的3种澄清剂进行两两复合试验，以期得到成本低、澄清好、用量少的新型复合澄清剂。

2.2 复合澄清剂对苹果酒澄清效果的影响

2.2.1 同比例添加量的3种复合澄清剂澄清效果

根据单因素试验结果分析，壳聚糖和皂土单独使用时有较好的澄清效果，结合成本的考虑，选用壳聚糖、皂土和蛋清3种澄清剂复合澄清使用，以达到互相补充提高澄清效果的作用见表1。

表1 复合澄清剂添加量对透光率的影响Table 1 The amount of compound clarifying agent influence on light transmittance

由表1可知，冷处理可加速苹果酒的澄清。冷处理时，壳聚糖-皂土的透光率最高，达到99.79%，高于皂土单一澄清剂的最佳透光率。虽然低于壳聚糖冷处理时3%添加量的透光率（为99.90%），不过壳聚糖-皂土复合澄清剂可以减少壳聚糖添加量，降低了成本而又能达到良好的澄清效果。未冷处理时，壳聚糖-蛋清复合澄清剂比蛋清澄清效果好，但是比壳聚糖澄清效果差，可能是壳聚糖和蛋清在发生吸附和电性中和作用时相互影响的原因。因此壳聚糖-皂土复合澄清剂为最佳复合澄清剂。

2.2.2 壳聚糖-皂土复合澄清剂澄清效果

壳聚糖-皂土复合澄清剂对苹果酒透光率的影响见表2。

表2 壳聚糖-皂土复合澄清剂对透光率的影响Table 2 The compound clarifying agent of Chitosan-bentonite effect on light transmittance

由表2可知，当添加壳聚糖1%-皂土3%时，透光率最高，冷处理时为99.88%，未冷处理时为99.56%，比未冷处理的单一澄清效果都好。说明皂土带负电的胶体微粒有效地吸附了带正电荷的混浊物，而壳聚糖形成带正电荷分子沉淀酒体带负电荷的混浊颗粒，与皂土互补作用，因而在合适添加量下可以达到比单一澄清剂更好的效果。另外，冷处理对于澄清度的提高具有显著的作用，可以加速混浊物质的凝聚沉淀，从而使酒体更加清澈透明。同时，添加壳聚糖1%-皂土5%比添加壳聚糖1%-皂土3%的澄清效果差，这是因为皂土的存在使苹果酒出现返浑。

此外，采用不同添加比例的壳聚糖-皂土-蛋清复合澄清剂的澄清试验，透光率较原酒有一定提高，但是远不及单一澄清剂和两种澄清剂复合的效果，这可能是因为3种澄清剂将酒体变成更为复杂的胶体溶液，反而严重影响絮凝浑浊成分，因而对3种澄清剂复合不进行下一步实验。

2.3 不同澄清剂处理对苹果酒基本指标的影响

为防止苹果酒的澄清试验对苹果酒成分的影响，测定苹果酒澄清后的酒精度、残糖、总酸等基本指标结果见表3。

表3 不同澄清剂澄清处理对苹果酒基本指标的影响Table 3 Different clarifying agent clarify deals effect on basic indicators of cider

续表3 不同澄清剂澄清处理对苹果酒基本指标的影响Continue table 3 Different clarifying agent clarify deals effect on basic indicators of cider

由表3可知，澄清剂处理后的苹果酒的酒度、总糖和总酸基本变化不大，保持了苹果原酒的风味。试验得出的含酸量为2.4 g/L～2.5 g/L，符合国家标准。添加了壳聚糖的苹果酒，其总酸含量有所增加，可能是因为配制壳聚糖时有用柠檬酸处理过，但不会影响苹果酒的风味。果胶酶处理苹果酒的含酸量比有少量提高，这可能是因为果胶酶在软化果酒中的果胶质将其分解为半乳糖醛酸和果胶酸。经澄清剂处理后的苹果酒，糖量变化不大，其中壳聚糖的残糖量会高一些，可能和壳聚糖本质是氨基葡萄糖的直链多聚糖有关。因此，可以采用澄清剂澄清苹果酒不会影响果酒的风味。

2.4 不同澄清剂降酚和降蛋白效果

研究[14]证明，用果实酿造而成的酒品中会含有较多的蛋白质和多酚类物质，在一定条件下，多酚类物质会与蛋白质形成络合物而沉淀，从而引起非生物性浑浊，严重影响苹果酒色泽及风味。研究不同澄清剂在冷处理条件下降酚及降蛋白效果见表4。

表4 不同澄清剂对苹果酒的降酚及降蛋白效果Table 4 Different clarifying agent of the amount of phenol and protein reduction effect of cider

由表4可知，澄清剂的添加都能使酒中的酚类物质含量比原酒有所降低，也降低了果酒的蛋白质含量。其中，壳聚糖的降蛋白效果最为显著，从处理前的290 mg/L下降到69 mg/L，而蛋清的降蛋白效果最差。这可能是因为蛋白质的下降与澄清剂的吸附作用有关。皂土的降酚效果最好，表明皂土吸附酚类物质的作用比吸附蛋白质要强。而壳聚糖分子链上的羟基和氨基官能团，对蛋白质的强结合作用大于对酚类物质的作用。

2.5 不同澄清剂对苹果酒非生物稳定性的影响

苹果酒稳定性是其保持品质的关键性质。因此，需考察澄清剂对苹果酒的非生物稳定性的作用，见表5。

表5 苹果酒的稳定性Table 5 The stability test result of cider

由表5可知，单一澄清剂和复合澄清剂处理过的苹果酒的非生物稳定性各项结果均呈阴性。酒石酸氢钾表现稳定，是因为苹果酒中的有机酸为苹果酸，酒石酸含量较低；铁、铜稳定性试验呈阴性，说明发酵过程中使用玻璃瓶，起到了防止铁性破败和铜性破败的作用，氧化稳定性试验呈阴性，表明酒液中的多酚类物质被澄清剂吸附减少，使被氧化聚合改变结构而絮凝析出，同时还可以说明在原料预处理中添加VC不但起到了护色作用，还起到了防止苹果酒发生氧化的效果。皂土可以吸附沉淀铁离子，提高抗铁破败的能力，这些物质的减少提高了苹果酒的稳定性。因此，添加澄清剂能提高苹果酒非生物稳定性。

3 结论

1）单一澄清剂

壳聚糖、皂土、蛋清有良好的澄清效果，其中壳聚糖的澄清效果最理想，添加量为3%并经过冷处理时，透光率可达到99.90%，果胶酶效果最差。经过澄清处理后的苹果酒理化指标变化不大。

2）复合澄清剂

复合澄清剂的澄清效果壳聚糖-皂土复合澄清剂澄清效果最好，能优于单一澄清剂，最佳添加量比例为壳聚糖1%～皂土3%。这种复合澄清剂既节省了成本，又能达到好的澄清效果，适合生产中使用。经复合澄清剂处理后的苹果酒的理化指标变化不大，果酒颜色变透明，有利于苹果酒的稳定与保存。

3）非生物稳定性

壳聚糖降蛋白效果最好，皂土的降酚效果最好。澄清后的苹果酒蛋白质、酒石酸氢钾、铁、铜以及氧化稳定性试验结果均呈阴性，表明单一和复合澄清剂能提高苹果酒的非生物稳定性。另外，冷处理有助于澄清和吸附色素，其澄清效果明显优于未冷处理。

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