急性冠脉综合征患者基质金属蛋白酶-9水平及与炎症因子相关性研究

闫 杰，郑 霞

心血管疾病是威胁人类健康最常见的疾病之一，其中急性冠状动脉综合征(acute coronary syndromes，ACS)发病率及死亡率有上升及日趋年轻化的趋势［1］。ACS包括急性心肌梗死(acute myocardia1 infarction，AMI)、不稳定型心绞痛(unstab1e angina，UA)和猝死。其诊断很大程度上要依赖于患者的临床表现、心电图和心肌损伤标记物。目前使用的心肌损伤标志物包括肌红蛋白、肌酸激酶同工酶、肌钙蛋白T和肌钙蛋白I，但它们仅在心肌细胞发生不可逆损害以及细胞膜的完整性被破坏之后才能被检出，因此，不利于早期心肌损伤可逆阶段的诊断［2－3］。细胞外基质降解增加和合成减少以及冠状动脉粥样硬化斑块的炎症反应是导致斑块不稳定继而引发ACS的主要因素。细胞外基质中基质金属蛋白酶(matrix meta11oproteinases，MMPs)是一类与斑块不稳定及破裂关系十分密切的蛋白水解酶类［4］。在防治动脉粥样硬化的过程中，适度地抑制MMPs活性可以提高斑块的稳定性，减少斑块破裂的发生。MMPs活性调节是一个十分复杂的过程，涉及多种刺激及抑制因素，目前对其了解还不十分全面。但适度地调节MMPs活性，改善细胞外基质重构将成为动脉粥样硬化防治研究的方向之一。有研究发现在不稳定斑块易发生破裂的肩部MMP－9的活性增加，MMP－9是造成斑块不稳定引发ACS的主要降解酶之一［2］。笔者主要研究ACS患者MMP－9 水平与肿瘤坏死因子－α(tumor necrosis factor－α，TNF－α)、白细胞介素－6(inter1eukin－6，IL－6)、白细胞介素－1β(inter1eukin －1β，IL－1β)等炎症刺激因子的相关性。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 超净工作台(上海跃进器械一厂型号:HHw21);CU600低温离心机、无菌吸管、滴管、低温冰箱，MMP－9、TNF－α、IL－6、IL－1β 等试剂盒均购自北京北方生物技术研究所。

1.2 实验对象及分组 选择2009年3月至2012年1月本院心内科收治的冠心病患者90例，并选健康对照组30例。AMI组30例，诊断标准:(1)缺血性胸痛持续≥30 min，用硝酸甘油症状不缓解;(2)相邻2个或更多导联ST段抬高，肢体导联≥0.1 mV，胸导联≥0.2 mV;(3)心肌酶动态变化。具有以上任何2项确诊。AMI患者必须为发病6 h以内。UA组30例，诊断标准:近48 h内有静息或自发心绞痛发作至少1次，但无心肌坏死的心肌酶谱改变，同时伴有心电图ST压低或T波的改变。稳定型心绞痛(stab1e angina，SA)组30例，诊断标准:近3个月心绞痛发作次数、诱发因素、缓解方式均保持稳定，运动实验阳性。所有患者均排除感染性疾病;高热及使用炎症抑制药物如非类固醇消炎镇痛药、类固醇;贫血;肿瘤;甲状腺机能亢进及结缔组织病;心功能不全;外周血管疾病或外周动脉硬化病;严重肝肾功能不全等。每例ACS患者均行冠状动脉造影术，明确病变后对血管行经皮腔内冠状动脉成型及支架植入术。对照组30例为同期冠脉造影显示无明显局限性狭窄者。各组年龄、性别等比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

1.3 实验方法 患者入院即刻留取外周脉血6 m1，静置1 h后3 000 r/min离心10 min，取上清液－20℃存储待测 MMP－9、TNF－α、IL－6 和 IL－1β。MMP－9、TNF－α、IL－6 和 IL－1β 的测定:采用双抗夹心酶联免疫吸附(ELISA)法。具体方法步骤如下:(1)将－20℃保存的备检标本于室温复融;(2)试剂盒从冰箱取出平衡至室温，根据说明配置不同浓度的标准品;(3)取出所需板孔，每孔中各加样品稀释液100 μ1，第一孔加标准品100 μ1，混匀后用加样器吸出100 μ1，移至第二孔。如此依次作对倍稀释至第七孔，最后，从第七孔中吸出100 μ1弃去，使之体积均为100 μ1，第八孔为空白对照;(4)加样:待测品孔中每孔加入待测样品100 μ1;(5)将反应板置于37℃ 120 min;(6)洗板:用洗涤液将反应板充分洗涤4～6次，用滤纸印干;(7)每孔中加第一抗工作液50 μ1;(8)将反应板充分混匀后置于37℃ 60 min;(9)洗板:同(6);(10)每孔加酶标抗体工作液100 μ1;(11)将反应板置37℃ 60 min;(12)洗板:同(6);(13)每孔中加入底物工作液100 μ1，置于37℃暗处反应5～10 min;(14)每孔加入1滴终止液混匀;(15)在450 nm处测吸光值;(16)分别计算出 MMP－9、TNF－α 、IL－6 和 IL－1β 的含量;以 OD 值为纵坐标，以标准品为横坐标，绘制标准曲线。根据样品的OD值可在标准线上查出其浓度。

1.4 统计学处理 应用SPSS 10.0统计软件包进行统计分析，主要统计指标均进行正态性检验，正态分布的各项统计指标均以均数±标准差(x±s)表示。采用直线相关分析法分析相关指标间相关性。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组患者血清中 MMP－9、TNF－α 水平 对照组、SA 组与AMI组、UA 组比较MMP－9 、TNF－α 水平差异有统计学意义(P＜0.05);AMI组与UA组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。

表1 各组患者血清中MMP-9、TNF-α水平(ng/L,±s)

表1 各组患者血清中MMP-9、TNF-α水平(ng/L,±s)

注:与对照组及SA组比较aP＜0.05;与UA组比较bP＜0.05。MMP－9 为基质金属蛋白酶－9，TNF－α 为肿瘤转移因子－α

组别 例数 MMP－9 TNF－α 30 14.79±6.32 18.7±5.4 SA组 30 16.21±5.74 27.4±3.6 AMI组 30 32.56±6.55ab 61.8±10.8ab UA组 30 24.78±5.76a 41.6±9.1对照组a

2.2 各组患者血清IL－6和IL－1β水平 对照组、SA组与 AMI组、UA 组比较血清 IL－6和 IL－1β 水平差异有统计学意义(P＜0.05)。AMI组与UA组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。

表2 各组患者血清IL-6、IL-1β浓度(ng/L，±s)

表2 各组患者血清IL-6、IL-1β浓度(ng/L，±s)

注:与对照组及SA组比较aP＜0.05;与UA组比较bP＜0.05。IL－6 为白细胞介素－6

组别 例数 IL－6 IL－1β 30 30.41±6.32 10.41±3.32 SA组 30 34.81±7.52 26.21±4.33 AMI组 30 53.37±12.70ab 56.78±6.52ab UA组 30 45.33±7.21a 42.73±5.42对照组a

2.3 各组患者 MMP－9、TNF－α、IL－6、IL－1β 相关性分析 对 MMP－9 与 TNF－α、IL－6、IL－1β 分别进行线性相关分析，结果发现 ACS患者 MMP－9与TNF－α 、IL－6显著相关(r=0.37，0.42，P＜0.05;r=0.45，0.51，P＜0.05)，与 IL－1β 呈弱相关性(r=0.236，0.259，P＜0.05);而 SAP组和对照组 MMP－9 与 IL－6和 IL－1β 无相关性(P＞0.05)。

3 讨论

ACS是一组由急性心肌缺血引起的临床综合征，患者的临床症状各异，其冠状动脉却具有非常相似的病理学改变，即冠状动脉粥样硬化斑块由稳定转为不稳定，继而破裂导致血栓形成［5］。不稳定斑块主要有以下特点［6］:(1)斑块内有一个大而松软的脂质核心;(2)纤维帽薄;(3)活化的炎症细胞浸润增强，包括巨噬细胞、泡沫细胞、T淋巴细胞和肥大细胞。在不稳定斑块破裂过程中，MMPs家族起到重要作用。

MMPs是一类与斑块不稳定及破裂关系十分密切的蛋白水解酶类，近年来的研究发现，MMPs参与了动脉粥样时的血管壁重构、斑块破裂、血栓形成等过程，其与动脉粥样斑块的形成、稳定及血栓性疾病等过程密切相关［7］。大量实验证实巨噬细胞源性的MMPs参与斑块的破裂［5－8］。肥大细胞和T淋巴细胞活化后，释放2种中性蛋白酶即胰蛋白酶和食糜酶，它们可激活巨噬细胞分泌 MMPs，其中有MMP－1，MMP－2，MMP－3 和 MMP－9，这些 MMPs 可以降解斑块纤维帽的所有胶原，使纤维帽变脆弱，引起斑块破裂。MMP－9是MMPs家族中的一员，是明胶酶的一种，又称明胶酶B。其为降解细胞外基质所需，参与了人类的各种生理和病理过程，在体内可被多种细胞，如单核细胞、巨噬细胞、成纤维细胞、中性粒细胞、血管平滑肌细胞、以及内皮细胞等分泌。其主要底物包括:明胶、胶原Ⅳ、V和弹性蛋白等。而Ⅴ型胶原是粥样斑块基底膜和纤维帽的重要组成部分，因此MMP－9在动脉粥样硬化斑块内细胞外基质降解过程中起着重要的作用［9］。斑块的破裂易发生于纤维帽的边缘处。这些易破裂的区域含有大量的巨噬细胞，而MMP－9主要存在于巨噬细胞丰富的肩部区域，因此普遍认为这些细胞及其释放的MMP－9引起斑块结构的破坏。心肌梗死等急性冠状动脉综合征引发的猝死多是由于冠状动脉粥样硬化斑块的破裂引起。本次试验表明，急性冠脉综合征患者血清中 MMP－9水平明显增高，说明MMP－9在分解细胞外基质致使不稳定斑块破裂导致ACS发病中起到了一定的作用。

炎症反应是斑块破裂的直接诱因，尸检发现［9］在不稳定或破裂的动脉粥样斑块内聚集着泡沫细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和肥大细胞，且在不稳定偏心斑块的肩部，炎症细胞浓度最高，也是最易发生破裂的部位，均提示了炎症导致斑块的不稳定、易破裂，在炎症因子中，TNF－α、IL－6、IL－1β 起重要作用。

TNF是一类能直接造成肿瘤细胞死亡的细胞因子，TNF－α作为一种前炎性细胞因子，是启动炎症反应的关键因子，导致血管内皮细胞损伤而引起的炎症反应是促使动脉粥样硬化发生发展的重要因素。IL－6是由活化的单核细胞、巨噬细胞、T淋巴细胞、内皮细胞及成纤维细胞等分泌的一种具有多种效能的细胞炎症因子，可促进T淋巴细胞增殖、分化、生成，促进B淋巴细胞增殖、分化，产生抗体，参与炎症过程［10］。其血清水平不仅可预测健康人群将来患心肌梗死的危险度，而且冠状动脉粥样硬化性心脏病(CHD)的预后也与之有关［11］。IL－1β 是一种激素样蛋白质，为发现最早的细胞因子之一，是由活化的内皮细胞、平滑肌细胞、淋巴细胞及单核巨噬细胞产生的，IL－1β是参与AS过程的一个重要因子，在AS斑块中的泡沫细胞IL－1β含量丰富，外周血单核细胞在吞噬大量氧化低密度脂蛋白(ox－LDL)后产生大量 IL－1β，IL－1β 一方面可激活单核－巨噬细胞、淋巴细胞产生多种细胞因子和生长因子，这些活性物质能改变血液动力学特性并促进动脉粥样化的形成［12］。

体外试验表明，损伤血管局部释放的IL－6、TNF－α可刺激血管平滑肌细胞使活化MMP－9的表达增高。这可能打破MMPs活性在局部的平衡状态，促进了血管基质的降解，从而有利于血管平滑肌细胞的移行。动物实验也表明了MMP－9的过表达增强了血管平滑肌细胞的移行［11］，用MMPs抑制剂几乎可完全抑制血管平滑肌细胞从中膜移行至内膜的数量。MMP－9基因消除鼠的体外研究颈动脉血管平滑肌细胞，与野生鼠的血管平滑肌细胞相比，也发现其移行活动降低［9］。

本研究表明，急性冠脉综合征患者血清中TNF－α、IL－6、IL－1β 水平明显增高，说明 TNF－α、IL－6、IL－1β在ACS的炎症反应发生中起到了作用。患者血清中 MMP－9 水平与 TNF－α、IL－6、IL－1β 水平有明显相关性，说明 MMP－9 水平与 TNF－α、IL－6、IL－1β 在ACS中共同发挥着作用。

［1］ Davies MJ.Reactive oxygen species，meta11oproteinases，and p1aque stabi1ity［J］.Circu1ation，1998，97(31):2382－2383.

［2］ Foda HD，George S，Ro11o E，et a1.Regu1ation of ge1atinases in human airway smooth musc1e ce11s:mechanism of proge1atinase A activation［J］.Am J Physio1，1999，277(2):174－182.

［3］ Kai H，Ikeda H，Yasukawa H，et a1.Peripheri1 b1ood 1eve1s of matrix meta11oproteinase 22 and 29 are e1evated in patients with acute coronary syndromes［J］.Am Co11 Cardia1，1998，32(4):368－372.

［4］ Rider PM，Rifai N，Stampfer MJ，et a1.P1asma concentration of inter1eukin－6 and the risk of future myocardia1 infarction among apparent1y hea1thy men［J］.Circu1ation，2000，101(29):1767－1772.

［5］ Luan Z，Chase AJ，Newby AC.Statins inhibit secretion of meta1－1oproteinases－1，2，3，and－9 from vascu1ar smooth musc1e ce11s and macrophages［J］.Atheriosc1er Thromb Vasc Bio1，2003，23(11):769－774.

［6］ Zhang B，Ye S，Herrmann SM，et a1.Functiona1 po1ymorphism in the regu1atory region of ge1atinase B gene in re1ation to severiry of coronary at herosc1erosis［J］.Circu1ation，1999，99(44):1788－1794.

［7］ B1ankenberg S，Poirier O，Bicke1 C，et a1.P1asma concent rations and genetic variation of matrix meta11oproteinase 29 and prognosis of patients with ardiovascu1ar disease［J］.Circu1ation，2003，107(12):5792－5851.

［8］ Morgan AR，Zhang B，Tapper W，et a1.Hap1otypic ana1ysis of the MMP－9 gene in re1ation to coronary artery disease［J］.J Mo1 Med，2003，81(5):321－326.

［9］ Desmet BJ，Dek1eijn D，Hanemaaijer R，et a1.Meta11oproteinase inhibition reduces constrictive arteria1 remode1ing after ba11oon angiop1asty:a study in the matherosc1erotic Yucatan micropig［J］.Circu1ation，2000，101(30):2962－2967.

［10］ Stemme S，Hanss on GK.I mmune mechanisms in ather ogenesis coron［J］.Ann Med，1994，26(3):141－146.

［11］ Leung T，Manser E，Tan L，et a1.A nove1 serine/threonine kinase binding the Ras 2 re1ated RhoA GTPase which trans1ocates the kinase to periphera1membranes［J］.J Bio1 Chem，1995，270(102):29051－29054.

［12］ Ozeren A，Aydin M，Tokac M，et a1.Leve1s of serum I－beta，IL－2，IL－8 and tumor necr osis factor 2 a1 pha in patientswith unstab1e angina［J］.Mediators Inf1amm，2003，12(5):361－365.