大鼠跟腱异位骨化模型中低氧诱导因子-1α及血管内皮生长因子的表达及作用

李国松 赫明堂 马立峰 杨延军 许思亮 张子清

大鼠跟腱异位骨化模型中低氧诱导因子-1α及血管内皮生长因子的表达及作用

李国松 赫明堂 马立峰 杨延军 许思亮 张子清

目的 通过观测大鼠异位骨化模型中低氧诱导因子-1α( hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)表达变化, 探讨HIF-1α、VEGF信号通路在异位骨化发生发展中的作用。 方法 SD大鼠60只随机分为实验组和对照组, 各30只, 实验组制备异位骨化模型。于 5、10 周取跟腱组织, RT-PCR及免疫印迹试验(Westen-blot)检测两组局部组织中HIF-1α及VEGF表达水平。结果 术后5、10周对照组 HIF-1α及VEGF表达量均显著低于实验组(P＜0.05)。结论 在大鼠跟腱异位骨化早期, HIF-1α及VEGF表达明显升高, 提示其对异位骨化发生、发展有重要作用。

低氧诱导因子； 血管内皮生长因子；异位骨化；大鼠

异位骨化是骨科领域中一种十分常见的疾病。研究表明HIF-1α可激活VEGF的表达, 在骨修复方面发挥重要作用［1］。本研究通过 建立大鼠跟腱异位骨化模型, 观察创伤早期不同时间点局部组织中HIF-1α及VEGF水平变化, 初步探讨HIF-1α及VEGF在异位骨化发生、发展中的价值。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 6～8龄雄性SD大鼠 60只, 平均体重(131.4± 11.6)g, SPF级环境饲养(深圳北京大学香港科技大学医学中心)。

1.1.2 主要试剂 HIF-1α多克隆抗体试剂盒, 抗鼠二抗, TRIzol、DNA Marker, 逆转录试剂盒。

1.1.3 主要仪器 PCR 扩增仪GeneAmp9600, 紫外线分光光度仪, Odyssey 红外线扫描成像系统, 琼脂糖凝胶显像系统4100、天能凝胶成像和分析系统4100。

1.2 动物模型制备及分组 60只大鼠适应性饲养1周后随机分为实验组和对照组, 每组30只。实验组：无菌条件下,于大鼠右后肢作后外侧入路暴露跟腱, 用血管钳反复钳夹5次, 造成一定创伤, 然后在中点将跟腱完全切断, 不予缝合,关闭切口。对照组：同实验组方法暴露跟腱, 不作任何处理,直接关闭切口。

1.3 观测指标

1.3.1 术后观察两组大鼠成活、切口愈合情况。各时间点观察两组大鼠跟腱大体形态。

1.3.2 免疫印迹试验(Western-blot)检测HIF-1α及VEGF蛋白含量 RT-PCR检测HIF-1α及VEGF基因表达。

1.4 统计学方法 采用SPSS13.0统计学软件进行分析。计量资料用均数±标准差( x-±s)表示, 采用t检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大体观察 所有大鼠均存活至实验完成, 切口愈合良好。术后10周, 实验组跟腱组织可见软骨样组织；对照组跟腱组织未见软骨样组织。

2.2 HIF-1α及VEGF蛋白及基因检测 各时间点实验组HIF-1α及VEGF的蛋白含量及基因相对表达量均显著高于对照组, 比较差异均有统计学意义(P＜0.05)。实验组组内不同时间点比较, HIF-1α及VEGF基因相对表达量各时间点比较, 差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

表1 HIF-1α、VEGF的蛋白及基因检测结果( x-±s, α=0.05, OD值)

3 讨论

异位骨化的发生、发展过程中, 呈明显的连续性。HIFs是组织细胞在低氧状态下诱生的转录因子, 包括3种亚型(HIF-1、HIF-2、HIF-3)。现在的研究集中于HIF-1及其感应元件HIF-1α［2］, 在血管重塑、葡萄糖和能量代谢、红细胞生成、细胞增殖、凋亡等方面发挥重要作用。低氧诱导因子(hypoxia inducible factors, HIFs)是诱导低氧基因和修复细胞氧内环境稳定的核心因子。

籍骨生长模型, 针对生长板区域的HIF-1α含量及其变化特性的研究发现, 生长板软骨细胞外基质呈梯度性缺氧状态, 诱导HIF-1α呈不同水平的表达, 其中央部位尤甚；软骨细胞HIF-1α基因条件性敲除后, 生长板中央处软骨细胞死(凋)亡。指出适量水平的HIF-1α可使软骨细胞尤其是早期肥大细胞存活期延长而使基质钙化逐渐弥散。当进行性升高的HIF-1α达一定程度, 便会通过信息呈递和(或)其主要靶基因-VEGF及其受体Flt-1(fms-like tyrosine kinase)、KDR(kinase domain region)介导, 诱导血管侵入, 有效的屏障作用而因此丧失, HIF-1α被降解, 如此交替, 这有可能是透明软骨雏形和出生后生长板软骨细胞分裂、增殖、肥大、变性、坏死和软骨基质的钙化, 有序而规律的主要调节机制［3,4］。对这些现象进一步的研究表明： HIF-1α在骨折修复重建过程中, 对软骨内成骨发挥了相同或类似的调节作用。

在HIF-1α的作用下, 其下游最关键的因子之一, VEGF已经被证明可以促进成肌细胞分化, 并增加其血管化和预防凋亡［5］。阐明其中的细胞分子生物学行为表现形式及其规律,将有可能成为加深认识创伤后异位骨化的生物学机制及其病损防治的新突破。因此, 自1992年发现HIFs以来, 这一反映生命活动氧依赖机制通路的重要组成部分, 其意义和前景倍受生命科学研究领域关注。

实验研究已经表明在未有其他干预条件下, HIF-1α能促进VEGF的表达, 从而促进血管化, 明显促进成骨细胞生成。本实验检测异位骨化过程中HIF-1α及VEGF的表达,初步探讨HEF-1α及VEGF对异位骨化的调控作用及其发生机制。这不仅有助于加深认识异位骨化形成机制, 发现导致异位骨化的问题所在, 而且将为提出新的治疗和防治创伤后异位骨化的措施提供可能。

［1］ 陈博, 陈剑秋.HIF-1α转染骨骼肌细胞的诱导产物VEGF对血管内皮细胞增殖的影响.天津医科大学学报, 2010, 16(3): 420-423.

［2］ 邵进, 邓廉夫.VHL/HIF信号转导通路在骨发育及其相关疾病中的调控机制.国际骨科学杂志, 2009, 30(4):254-256, 260.

［3］ 朱海云, 李银平.缺氧诱导因子及其在炎症中的作用进展.中国中西医结合急救杂志, 2010, 17(1):60-62 .

［4］ 张纲, 李焰, 谭颖徽.细胞生长因子在骨折愈合中的作用研究进展.重庆医学, 2008, 37(2):196-197.

［5］ 徐用亿, 马金忠.骨性关节炎中组织血管发生的研究进展.生物骨科材料与临床研究, 2010, 7(1):33-35.

Expressions and effects of hypoxia inducible factor-1α and vascular endothelial growth factor in rat Achilles tendon heterotopic ossification model

LI Guo-song, HE Ming-tang, MA Li-feng, et al.
Guangdong Shenzhen City Longgang District Orthopaedic Hospital, Shenzhen 518116, China

Objective To observe expression changes of hypoxia inducible factor-1α (HIF-1α) and vascular endothelial growth factor (VEGF) in rat Achilles tendon heterotopic ossification model, and to investigate effects of HIF-1α and VEGF signal path in occurrence and progression of heterotopic ossification.Methods A total of 60 SD rats were randomly divided into experimental group and control group, and each group contained 30 cases.Heterotopic ossification model was made in the experimental group.Achilles tendon tissues were taken in 5 and 10 weeks for detection of HIF-1α and VEGF expression levels by RT-PCR and Western-blot test.Results In 5 and 10 weeks after operation, the control group had obviously lower HIF-1α and VEGF expression levels than the experimental group (P＜0.05).Conclusion Remarkably increased HIF-1α and VEGF expression levels in early stage of rat Achilles tendon heterotopic ossification provides important effects for occurrence and progression of heterotopic ossification.

Hypoxia inducible factor; Vascular endothelial growth factor; Heterotopic ossification; Rat

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2015.14.191

2015-01-12］

518116 广东省深圳市龙岗区骨科医院