PCR-RLFP方法检测eNOS G894T多态性实验条件研究

安新焕 武会娟 梁干雄

·实验研究·

PCR-RLFP方法检测eNOS G894T多态性实验条件研究

安新焕 武会娟 梁干雄

目的 探讨聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术检测内皮细胞型一氧化氮合酶(eNOS) G894T多态性的最佳实验条件。方法 对PCR和RFLP的一些影响因素进行研究。结果 PCR扩增eNOS基因的最佳条件为：20 μmol/L的引物浓度； 5.0 U的Taq酶量； 112 μmol/L的dNTP浓度。20 μl体系中加4 μl产物, 5.0 U的酶消化4 h为最经济有效的酶切体系。结论 最佳的实验条件的探索是进行大批量实验研究的关键。

内皮细胞型一氧化氮合酶；G894T；多态性； 聚合酶链反应-限制性片段长度多态性；最佳实验条件

糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病(diabetes mellitus, DM) 患者致命的主要原因之一 。并非所有的DM患者均发生DN, 有些患者尽管血糖控制良好, 却发生肾损害［1］；有半数以上DM患者无论血糖控制如何终生不发生DN, 此种异质性不能用代谢调节的差异来解释 。因此提示遗传因素在DN或至少在部分DN的发病中起重要作用。有研究表明, eNOS基因是DN的候选基因。在肾脏, eNOS 主要存在于血管内皮细胞, eNOS 是血管内皮细胞NO 合成的主要限速因子, eNOS 的功能障碍将影响血管壁NO 基础水平, 影响糖尿病微血管病变的发生。血浆NO 水平的变化30%是由于eNOS 基因多态性所致。eNOS 基因第7 外显子G894T多态性, 可影响eNOS 蛋白功能, 使血浆NO 水平下降, 在糖尿病肾病的发生发展中有重要作用。另有研究表明［2］, eNOS与ACE基因多态性并存对糖尿病肾病有一定的影响。作者检测eNOS 基因第7 外显子G894T多态性, 并研究分析此种多态性是否与中国广东地区汉族人DN有关系。PCR-RFLP方法借助限制性内切酶对识别碱基序列的特异性切割, 用来检测基因片段中某一位点的变异情况。eNOS 基因第7 外显子894位点对应限制性内切酶BanⅡ的酶切位点, 酶切后有3种情况：基因型为GG的不含突变位点, 酶切后为163 bp 和85 bp 两个片段;TT基因型酶切后只有一个248 bp 片段, 存在G→T 点突变；GT基因型酶切后得到3个片段即248 bp , 163 bp 和85 bp 。

尽管PCR-RFLP是比较成熟的技术, 但对于不同的模板和引物, PCR反应所需的条件是不同的。如果实验条件把握不准确, 可造成假阴性或假阳性结果, 酶切反应对于产物多少、酶量及酶切时间也有讲究, 对于大批量研究而言, 探索实验条件是必需的。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器材料 基因扩增仪BIO-RAD S1000；电泳仪Power Pac 3000型由美国BIO-RAD公司生产及配套的分析软件和Power Pac1000紫外图像分析系统, 5417R高速冷冻离心机由德国Eppendorf公司生产制造, 恒温和可控水浴箱由上海医疗器械厂生产制造。

1.1.2 主要试剂 由北京市理化分析测试中心合成引物：上游引物：5’-AAG GCA GGA GAC AGT GGA TGG A-3’, 下游引物5’-CCC AGT CAA TCC CTT TGG TGC TCA-3’ , TaqDNA聚合酶标准为5.0 U/μl、100 mmol/L的dNTP和限制性内切酶BanⅡ均为宝生物(大连)有限公司生产, 从天根生化科技(北京)有限公司购得DNA分子量标记(Marker)。实验用水为去离子水。

1.2 实验方法

1.2.1 模板DNA的抽提 选用QIAamp DNA Mini kit试剂盒按说明书提取模板DNA, 加入100 ml TE缓冲液, DNA沉淀物放在65℃水浴中15～20 min, 直到沉淀物质完全溶解, 储存方法:放在4℃的冰箱中。

1.2.2 PCR扩增 建立PCR扩增目的DNA片段的实验条件。模板1 μl, 10×缓冲液5 μl, 加去离子水至501μl作为基本反应体系, 对影响扩增结果的Taq酶量、dNTP、引物的浓度等进行变化, 按94℃预变性5 min, 后94℃ 45 s, 60℃ 45 s, 72℃ 1 min进行30个循环, 最后72℃延伸5 min。扩增产物用琼脂糖凝胶电泳法检测：将扩增产物10 μl与溴酚蓝加样缓冲液2 μl混匀后和1份5μl MarKer同时加样于2%的琼脂糖凝胶(含0.5 μg/ml溴乙锭), 用100 V电压电泳30 min, 电泳后在Gel Doc1000紫外检测系统中观察扩增产物的电泳结果。

1.2.3 BanⅡ限制性内切酶的酶解 GG基因型酶切后有2个片段163 bp 和85 bp；TT基因型只有1 个248 bp 的片段；GT基因型酶切后有3个片段即248 bp、163 bp和85 bp。采用过度酶量消化的办法找到基因型为GG的野生纯合子, 即5 μl扩增产物, 用10.0 U的内切酶消化, 反应体系20 μl, 然后20 μl总反应体系不变, 对扩增产物量、内切酶的浓度、酶切时间按梯度设定。酶切后产物的检测也采用琼脂糖凝胶电泳法,按上述同样方法进行加样, 10 μl酶切产物在80 V电压下电泳45 min, 然后在Gel Doc 1000紫外检测系统中观察结果。

2 结果

2.1 PCR实验条件

2.1.1 Taq酶量设定在2.5～15.0 U之间, 其他扩增条件不变。结果表明, 不同酶量均能扩增出目的DNA片段, 且产物量无显著性差异。所以选择5.0 U的Taq酶量, 既有效又节省酶量。见图1。

2.1.2 引物浓度设计在10～100 pmol/ul, 其他条件不变。结果是均有产物扩出, 但随着引物浓度增加, 引物二聚体也逐渐增加, 产物量并不增加, 所以选择引物浓度20 pmol/ul, 此时二聚体较少, 产物量高。见图2。

2.1.3 dNTP浓度设计在28～168 μmol/L之间, 其他扩增条件不变。结果是随着dNTP浓度的增加产物量有所增加, 但在112 μmol/L后产物量并无变化, 选择其最适dNTP浓度为112 μmol/L。见图3。

图1 Taq酶量对PCR的影响注：M为D2000的DNA分子量标记,依次为100、250、500、750、1000、2000 bp；1～6分别为2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 以及15.0 U的Taq酶量

图2 引物浓度对PCR的影响注：M为D2000的DNA分子量标记,依次为100、250、500、750、1000、2000 bp；1～6分别为10、20、30、40、50以及100 pmol/ul的引物浓度

图3 dNTP浓度对PCR扩增的影响注：M为D2000的DNA分子量标记, 依次为100、250、500、750、1000、2000 bp；1～6分别为：28、56、84、112、140和 168 μmol/L的dNTP浓度

2.2 BanⅡ内切酶实验条件

2.2.1 酶切反应体积 50 μl的酶切体系是一般试剂盒的标准体系, 而RFLP只需要酶切后电泳检测得出酶切图谱, 无后续实验需要, 因此设定反应体积为20 μl即可满足要求。

2.2.2 确定酶切所用的扩增产物量 选择GG基因型的扩增产物来酶切, 10.0 U内切酶, 分别消化2～8 μl的扩增产物,过夜酶切。结果表明：2、4、6、8 μl的扩增产物均可被切开,但6、8 μl的扩增产物酶切后虽不影响基因型判断, 但遗留极少量未被切干净的痕迹, 2 μl扩增产物酶切后电泳无法分辨基因型, 而4 μl时结果清晰可辨。所以最佳酶切产物量为4 μl, 既能保证酶切完全又防止扩增产物过多对内切酶抑制。见图4。

2.2.3 酶切的酶量确定 加入4 μl扩增产物量, 2.5～10.0 U将内切酶量设计为4个梯度, 过夜酶切。结果表明：5.0、7.5、10.0 U时均呈现清晰的163 bp一条片段(因为85 bp片段看不到), 而2.5 U的酶量不能完全切开, 所以选择5.0 U内切酶量。见图5。

2.2.4 酶切时间的确定 反应体积为20 μl, 加入4 μl扩增产物, 5 U内切酶, 酶切时间设置为1～10 h。结果表明：1 h酶切不能完全切割, 248 bp处遗留少量痕迹, 而4 h后可以完全切割, 248 bp处不留痕迹, 而且随酶切时间延长并未发现非特异性切割, 所以最佳酶切时间为4 h。见图6。

图4 扩增产物量对酶切的影响注：M为D2000的DNA分子量标记, 依次为100、250、500、750、1000、2000 bp；1、2、3、4依次为酶切模板8、6、4、2 μl

图5 内切酶量对酶切的影响注：M为D2000的DNA分子量标记, 依次为100、250、500、750、1000、2000 bp ；1、2、3、4依次为内切酶2.5、5.0、7.5、10.0 U的BanⅡ内切酶量

图6 酶切时间的确定注：D2000为DNA分子量标记, 依次为100、250、500、750、1000、2000 bp ；1、2、3、4 分别为酶切1、4、7、10 h

3 讨论

PCR-RFLP方法是常用的检测点变异的方法, 实验条件随着内切酶及切割片段长度的不同而不同, 而对于大批量实验而言, 若要保证实验结果准确可靠, 实验条件需要优化。

扩增后的产物需要酶切后才能判断基因型, 因此扩增产物要求量足又要特异性高, 引物二聚体较少。对于实验条件的诸多影响因素, 作者选择主要的影响因素如Taq酶量、引物浓度以及dNTP浓度等进行实验条件的优化。①Taq酶量：Taq酶活性对于不同来源和不同批次会有不同, 会影响扩增效果, 所以, 同一研究中最好使用同一批次的Taq酶。得到的扩增产物量足够酶切, 出于降低检测成本考虑, 选择低浓度的酶即可。②引物浓度：引物浓度对扩增效率和特异性均有影响。引物浓度低扩增效率极低, 不能满足实验要求, 引物浓度过高, PCR反应特异性下降, 错配增加, 引物二聚体增多［3］。③dNTP的浓度：PCR扩增体系中有4种dNTP, 并且要求等摩尔浓度, 否则会诱发聚合酶的错误掺入, 降低新链合成速度［4］。dNTP浓度低时反应产量也低, 而dNTP浓度高时对扩增反应有抑制作用, 可能是因为dNTP与Mg2+螯合而引起的反应［4］。④内切酶量以及酶切所用扩增产物量：这两种条件是密不可分的, 内切酶量和扩增产物量的多少在一个反应体系中是相对而言的, 内切酶量少, 产物切不开或切不完全, 无法判断结果；扩增产物量多使得内切酶量相对不足, 甚至会对内切酶产生抑制作用［5］, 内切酶量过多又造成浪费, 增加实验成本。⑤酶切时间：虽然试剂盒上都有参考的酶切时间, 但在不同的反应体系中, 不同的实验条件下,需要重新确定酶切时间。酶切时间的延长, 并不能减少所用的内切酶量, 反而会因为酶切时间过长而使内切酶酶活性丧失, 甚至会造成内切酶星号活性(在非标准反应条件下切割与内切酶识别顺序相似的序列)的发生［5］, 时间过短又不能完全切割特异性片段, 内切酶的作用也未发挥完全, 影响结果判断。电泳时间过长会造成条带模糊不清, 甚至DNA从凝胶中泳出, 过短会造成片段分不开, 每次电泳时间不一致会造成横向无法比较。

实验条件之间互相影响、互相关联, 优化实验条件后确定了PCR-RFLP方法扩增eNOS 基因第7 外显子区进而进行内切酶消化的适宜实验条件, 为实验结果的准确可靠奠定了基础。

总之, PCR扩增eNOS 基因第7 外显子区的适宜条件：20 μmol /L的引物浓度；5 U的Taq酶；112 μmol/L的dNTP浓度；BanⅡ酶切的最适条件：20 μl的酶切体系中, 加入4 μl酶切产物, 5.0 U内切酶, 酶切4 h。以上参数偏离最适条件将会影响实验结果。

［1］ Dudek AZ, Pawlak WZ, Kirstein MN.Molecular targets in the inhibition of angiogenesis.ExpertOp on Ther Targets, 2003, 7(4): 527-541.

［2］ Zohreh R, Asad VR, Ziba R, et al.Concomitant presence of endothelial nitric oxide 894T and angiotensin Ⅱ-converting enzyme D alleles are associated with diabetic nephropathy in a Kurdish population from Western Iran.Nephrology, 2012, 17(2):175-181.

［3］ 张维铭.现代分子生物学实验手册.北京：科学出版社, 2003: 251.

［4］ 萨姆布鲁克, 拉塞尔.分子克隆实验指南.第3版.北京：科学出版社, 2002:599.

［5］ 孙晗笑, 陆大祥, 刘飞鹏.转基因技术理论与应用.郑州：河南医科大学出版社, 2000:178-179.

Experimental condition research of PCR-RLFP in detection of polymorphism of eNOS G894T

AN Xinhuan, WU Hui-juan, LIANG Gan-xiong.
Department of Endocrinology, Guangdong Zhongshan City People’s Hospital, Zhongshan 528400, China

Objective To investigate the optimum experimental condition of polymerase chain reactionrestricted fragment length polymorphisms (PCR-EFLP) in detection of polymorphism of endothelial nitric oxide synthase (eNOS) G894T.Methods Research was made on influencing factors of PCR and RFLP.Results The optimum experimental conditions for PCR in amplification of eNOS gene included primer concentration as 20 μmol/L, Taq enzyme amount as 5.0 U, and dNTP concentration as 112 μmol/L.4 μl products in 20 μl system under 4 h of 5.0 U enzymic digestion was the most financial enzymatic system.Conclusion Investigation of the optimum experimental condition is the key to implement large quantities of experiments.

Endothelial nitric oxide synthase; G894T; Polymorphism; Polymerase chain reactionrestricted fragment length polymorphisms; Optimum experimental condition

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2015.14.190

2015-04-17］

528400 广东省中山市人民医院内分泌科(安新焕 梁干雄)；北京市理化分析测试中心(武会娟)