黑胡椒提取物对枯草芽孢杆菌生理代谢的影响

邹 兰,胡月英,陈文学,*

(1.海南大学食品学院,海南海口 570228;2.海南大学材化学院,海南海口 570228)

黑胡椒提取物对枯草芽孢杆菌生理代谢的影响

邹 兰1,胡月英2,陈文学1,*

(1.海南大学食品学院,海南海口 570228;2.海南大学材化学院,海南海口 570228)

本文以枯草芽孢杆菌作为供试菌,分别研究了经4个不同有机相的胡椒提取物处理后的枯草芽孢杆菌细胞内的丙酮酸含量以及转氨酶活性的变化,探讨了胡椒提取物的抑菌机理。结果表明,处理后的枯草芽孢杆菌菌体内的丙酮酸出现积累,其中以乙酸乙酯相的丙酮酸浓度最高,为0.527 g/L;此外,胞外谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)活力增强,最高酶活力分别为28.62 Kar U和49.29 Kar U。这说明了胡椒提取物能破坏枯草芽孢杆菌的正常生理代谢,从而有效地抑制枯草芽孢杆菌的生长。

胡椒提取物,抑菌机理,枯草芽孢杆菌

长久以来,延长食品的货架期,保证食品的安全以及品质一直都是食品企业以及政府部门关心的问题。食品货架期是指在标签上规定的条件下，保持食品质量(品质)的期限。影响食品货架期的因素有:食物本身、环境因素、食品的包装质量[1]。为防止食品的腐败、变质,延长食品货架期,保持食品新鲜度,需要在食品中添加防腐剂。常见防腐剂有三种类型:化学防腐剂、天然防腐剂和益生菌[2]。

近几年,人们对中草药和植物精油的抗菌、抗病毒和抗氧化特性的研究越来越感兴趣。有些植物精油还被用做食品防腐剂[3]。随着人们对天然成分和无化学防腐剂食物的需求增大,天然的防腐剂将会越来越受到人们的青睐。如今,对药用植物和香辛料的抗微生物活性的研究也已经成为一种趋势[4]。胡椒是一种药食同源的香辛料,在我国的广西、云南、台湾、海南等地有广泛的种植。目前,其在海南的种植面积约13.3万hm2,产量高达1.2万t[5]。胡椒可加入药材中使用,具有镇静、止痛、消炎等功能;此外,胡椒还有抗癌、抗惊厥、杀虫、消炎解热等活性[6-8]。有研究表明[9-11],胡椒的醇提取物以及胡椒挥发油对常见的食品腐败菌有较强的抑制作用。杨敏[12]等人研究了黑胡椒5种不同有机相提取物及两种常用防腐剂对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌、黑曲霉的最小抑菌浓度(MIC),胡椒提取物对这5个菌都有较强的抑菌活性,但并未对某一特定菌的生理代谢进行研究。本文通过对枯草芽孢杆菌丙酮酸含量及转氨酶活性的测定,研究了胡椒提取物对菌体生长代谢的影响,为进一步揭示胡椒提取物的抑菌机理奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黑胡椒购自南国超市;枯草芽孢杆菌菌种 来自于海南大学食品学院微生物实验室;乙醇、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇等试剂 均购自天津市富宇精细化工有限公司,均为分析纯;牛肉膏、琼脂 均购自北京索莱宝科技有限公司;蛋白胨 购自广东环凯微生物科技有限公司;丙酮酸标准样品和2,4-二硝基苯肼(DNP) 购自阿拉丁公司;α-酮戊二酸、L-天冬氨酸、L-丙氨酸 均购自于上海源叶生物科技有限公司。

FW177型中草药粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司;WF-300EH型超声清洗机 宁波海曙五方超声设备有限公司;RE52CS型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;ZHWY-211B型恒温培养振荡箱 上海智诚分析仪器制造有限公司;SW-CJ-1FD型洁净工作台 苏州佳宝净化工程有限公司;722型可见分光光度计 上海欣茂仪器有限公司;冷冻离心机 美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 实验方法

1.2.1 胡椒抑菌物质的提取 根据胡椒抑菌活性物质提取的最佳条件[13],利用体积分数为80%的乙醇溶液浸泡胡椒粉末480 min,经抽滤及真空减压浓缩得到膏状胡椒提取物(胡椒油树脂),置于4 ℃冰箱保存备用。采用液-液萃取法对胡椒粗提物进行分离纯化,分别用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇作为萃取剂,收集萃取液并经真空浓缩蒸发依次得到石油醚相提取物、氯仿相提取物、乙酸乙酯相提取物、正丁醇相提取物。

1.2.2 菌种的活化及培养 将枯草芽孢杆菌在牛肉膏蛋白胨培养基中活化后保存备用。用0.9%的NaCl来制备含菌量在106～107cfu/mL范围内的菌体悬浮液。将1 mL的菌悬液加入到49 mL的牛肉膏蛋白胨液体培养基中。实验组中加入终浓度为MIC的用80%的酒精溶解后的胡椒各个有机相提取物,对照组中加入相同体积的乙醇。各组均在转速为130 r/min的37 ℃的摇床培养箱中培养24 h。

1.2.3 丙酮酸含量的测定

1.2.3.1 丙酮酸标准曲线的绘制 丙酮酸含量的测定可采用苯肼[14],首先准确称取0.4 g丙酮酸,充分溶解于去离子水中,定容至200 mL,配制成2 g/L的标准丙酮酸溶液,再分别稀释成不同浓度的丙酮酸溶液。试管中依次加入1 mL 2,4-二硝基苯肼(DNP)和0.1 mL不同浓度的丙酮酸标准溶液,37 ℃水浴20 min,再加入10 mL NaOH(0.4 mol/L),摇匀,测其在520 nm下的吸光度值。

1.2.3.2 处理菌液丙酮酸含量的测定 参考文献[15],实验组和对照组均在1、4、7、10、13、24 h分别取样后,于转速为6000 r/min的条件下离心15 min,取上清液1 mL并稍微稀释,使浓度处在标准曲线的范围内。将1 mL DNP试剂和0.1 mL稀释样品(加入0.3 mL 8%三氯乙酸)加入到试管中,37 ℃水浴反应10 min,再加入10 mL的0.4 mol/L NaOH溶液,摇匀。以不加胡椒提取物的培养物为空白对照,测各组在520 nm处吸光值,根据标准曲线即可计算得样品中的丙酮酸浓度。

1.2.4 转氨酶活性的测定

1.2.4.1 转氨酶标准曲线的绘制 转氨酶活性的测定采用赖氏法[16]。首先配制0.1 mol/L磷酸盐溶液(pH7.4)、2 mmol/L的丙酮酸标准溶液、1 mmol/L的2,4-二硝基苯肼(DNP)以及0.5 mol/L的NaOH,然后再配制谷丙转氨酶(ALT)底物液(包含0.2 mol/L的L-丙氨酸,2.0 mmol/L的α-酮戊二酸和0.1 mol/L磷酸盐溶液(pH7.4))和谷草转氨酶(AST)底物液(包含0.2 mol/L的L-天门冬氨酸,2.0 mmol/L的α-酮戊二酸和0.1 mol/L磷酸盐溶液(pH7.4))。ALT标准曲线测定时,分别在试管中加入磷酸缓冲液、丙酮酸标准溶液和ALT底物液,混匀,在37 ℃下水浴加热30 min;AST标准曲线测定时,分别在试管中加入磷酸缓冲液、丙酮酸标准溶液和AST底物液,混匀,在37 ℃下水浴加热60 min;然后,各管均加入0.5 mL的DNP,混匀,37 ℃下水浴加热20 min;再加入5 mL 0.5 mol/L的NaOH溶液,混匀,37 ℃下水浴加热10 min,取出,冷却至室温,在波长为505 nm下测定其吸光光度值,以吸光光度值为横坐标,对应的卡门氏单位(Kar U)为纵坐标,绘制出ALT和AST的标准曲线。

1.2.4.2 处理菌液转氨酶活性的测定 参考文献[17],加药组与对照组分别在0、4、8、12、24 h取样,于4 ℃下离心(10000 r/min,10 min)后,取上清液保存于冰水中。将0.5 mL的ALT底物液和AST底物液分别转移到试管中并在37 ℃水浴中加热5 min。取0.1 mL上清液于上述试管中并快速混匀后置于水浴(37 ℃)中加热(ALT,30 min;AST,60 min)。再取0.5 mL DNP加入到各个试管中,混匀并于37 ℃水浴中反应20 min,在室温下冷却10 min。再加入5 mL 0.5 mol/L的氢氧化钠,混匀后于37 ℃水浴中反应10 min,然后在505 nm下测其吸光度。通过与标准曲线比对计算出AST和ALT的活性。

2 结果与分析

2.1 胡椒提取物对菌液丙酮酸含量的影响

丙酮酸是连接糖酵解途径、三羧酸循环和氧化磷酸途径的重要的关键中间代谢产物,如果丙酮酸积累,会对细胞的产能和物质代谢产生影响,扰乱细菌正常的代谢过程[18-19]。图1为丙酮酸的标准曲线,图2是由与标准曲线比对得到的不同时间点取样后相应样品的丙酮酸含量。枯草芽孢杆菌对照组的丙酮酸含量随着时间的延长而降低,氯仿相萃取物组的菌液丙酮酸含量在前4 h内含量减少,之后呈逐渐上升趋势。石油醚、正丁醇和乙酸乙酯萃取物组的菌液丙酮酸含量随着时间的延长呈现明显的上升趋势。其中以乙酸乙酯相的丙酮酸含量最高,在24 h时达到0.527 g/L。结果表明:各实验组的丙酮酸含量都呈现了不同程度的积累。

图1 丙酮酸标准曲线Fig.1 The pyruvate acid standard curve

图2 胡椒提取物对枯草芽孢杆菌的丙酮酸浓度的影响Fig.2 Effect of pepper extract on B. subtilis pyruvate acid content

2.2 胡椒提取物对菌液转氨酶活性的影响

转氨酶[20]是一种胞内酶,它不仅能催化机体合成非必需氨基酸,而且可以通过转氨基作用使大多数氨基酸脱氨基。氨基酸的氧化分解途径虽然各不相同,但是它们最后形成产物如丙酮酸、延胡索酸和草酰乙酸等产物会进入三羧酸循环[21]。因此,如果转氨酶泄漏,胞内转氨酶活性降低,必将导致转氨基反应受阻,这将导致多肽及蛋白质的合成受到影响。图3和图5分别是谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)的标准曲线。图4和图6是根据ALT和AST标准曲线比对后得到的枯草芽孢杆菌的酶活力。由图4可知,枯草芽孢杆菌对照组的ALT活力显著低于各实验组的ALT活力。在前8 h,各个实验组的ALT活力均呈上升趋势,随后下降,在12～24 h内,除了乙酸乙酯相菌液的ALT活力出现降低外,其余各实验组的酶活力有都有所增加。氯仿相、石油醚相、正丁醇相和乙酸乙酯相的最终ALT酶活力高于对照组,且经正丁醇相处理后细菌的酶活力最高,达到28.62 Kar U。而图6显示了枯草芽孢杆菌经胡椒提取物处理后各组在24 h内AST活力的变化曲线。由图6知:实验组和对照组在前4 h内AST的活力均呈上升趋势;在4～8 h内,AST活力稍有降低,但经氯仿相胡椒提取物处理的菌液在前8 h一直呈上升趋势。8 h后,对照组的AST酶活力降低,其余实验组的酶活力上升,尽管氯仿相组的菌液AST活力出现下降,但其活性仍然高于对照组,且其最终AST酶活力出现了上升趋势。这可能是因为细胞壁遭到破坏,并且细胞膜的通透性增大,导致胞内酶外泄[22]。氯仿相、石油醚相、正丁醇相和乙酸乙酯相的最终AST酶活力分别达到了41.68、39.20、34.92、49.29 Kar U,均高于对照组的22.63 Kar U,且经乙酸乙酯相处理后,胞外AST酶活力最强。

图3 ALT标准曲线Fig.3 The ALT standard curve

图4 胡椒提取物对枯草芽孢杆菌ALT活力的影响Fig.4 Effect of pepper extract on B.subtilis ALT activity

图5 AST标准曲线Fig.5 The AST standard curve

图6 胡椒提取物对枯草芽孢杆菌AST活力的影响Fig.6 Effect of pepper extract on B. subtilis AST activity

3 结论与讨论

本实验通过考察枯草芽孢杆菌菌体内丙酮酸含量、ALT和AST活力的变化,研究了胡椒的不同提取物对枯草芽孢杆菌生长代谢的影响。结果表明:经胡椒提取物处理的菌液,其丙酮酸均出现不同程度的积累,其中以乙酸乙酯相萃取物处理的菌液丙酮酸含量最高;此外,胞外ALT和AST的活性增强,表明胡椒提取物破坏了菌体细胞的细胞膜,增大了细胞膜的通透性,导致酶的泄漏。同时,由于酶的泄漏,导致胞内酶减少,活性降低,影响了细胞内多肽和蛋白质正常的合成和分解代谢。由此,可推断其抑菌机理是胡椒提取物影响了菌体的正常代谢途径,导致供给细胞生长繁殖所需的能量和关键物质不能及时合成,导致菌体衰亡。

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Effect of pepper extract on the physiological metabolism ofBacillussubtilis

ZOU Lan1,HU Yue-ying2,CHEN Wen-xue1,*

(1.College of Food Science and Technology,Hainan University,Haikou 570228,China;2.Materials and Chemical Engineering,Hainan University,Haikou 570228,China)

Considering that black pepper extracts inhibit food spoilage and food pathogenic bacteria,the antimicrobial mechanism of four different organic phases of pepper extract againstBacillussubtiliswere explored. The antibacterial mechanism of pepper extract was elucidated by analyzing pyruvic acid content and transaminases activities of the target bacteria. The extract significantly increased pyruvic acid concentration in bacterial solutions,especially with the treatment of ethyl phase,the concentration of pyruvic acid were up to 0.527 g/L.And the activity levels of ALT and AST in the cultures of bacterial cell were increased severely with adding pepper extracts,and the highest enzyme activity was 28.62 and 49.29 Kar U,respectively. The results indicated that pepper extracts inhibited the metabolic and energy synthesis ofBacillussubtilis,which consequently affected the growth and metabolic ofBacillussubtilis.

pepper extract;antibacterial mechanism;Bacillussubtilis

2015-03-27

邹兰(1992-)，女，硕士研究生，研究方向：食品科学，E-mail：18289765565@163.com。

*通讯作者:陈文学(1968-)，男，硕士，副教授，研究方向：热带农产品贮藏与加工研究，E-mail:hnchwx@163.com。

海南大学博士启动基金(kyqd1224)。

TS201.1

A

1002-0306(2015)23-0148-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.23.022