美味牛肝菌(Boletusedulis)对镉(Ⅱ)的生物富集特性研究

李金城,鲍长俊,孙 云,庄永亮,孙丽平

(昆明理工大学云南省食品安全研究院,云南昆明 650500)

美味牛肝菌(Boletusedulis)对镉(Ⅱ)的生物富集特性研究

李金城,鲍长俊,孙 云,庄永亮*,孙丽平

(昆明理工大学云南省食品安全研究院,云南昆明 650500)

本文研究了美味牛肝菌液体发酵对不同浓度镉(Ⅱ)(Cd2+,0、16、32、48、64、80 mg/L)的生物富集特性。结果表明,Cd2+处理显著抑制了美味牛肝菌菌丝体的生长(p<0.05),生长抑制率为50%的Cd2+浓度为56 mg/L。菌丝体对Cd2+的生物富集量可高达3335.7 mg/kg DW,富集系数为52.1(p<0.05)。菌丝体中可溶性总糖和多糖含量随Cd2+浓度的升高呈现先上升后下降的趋势,Cd2+处理菌丝体中的多糖含量均高于无Cd2+组(p<0.05);菌丝体中可溶性蛋白含量随Cd2+浓度的升高先降低后上升,80 mg/L Cd2+处理组显著高于无Cd2+组(p<0.05)。Cd2+处理对菌体过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活性呈现显著的“低促高抑”的影响趋势(p<0.05),而过氧化物酶(POD)活性被显著抑制(p<0.05)。表明美味牛肝菌对Cd2+具有很强的生物富集能力,可能是菌体的特定成分如多糖、蛋白等协同抗氧化酶系增强了菌体对Cd2+的耐受性和富集性能。

美味牛肝菌,镉,生物富集,食品安全性

美味牛肝菌(Boletusedulis),俗称白牛肝、大脚菇,属于担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、牛肝菌科,是一种世界范围内分布的食药兼用的真菌。美味牛肝菌在云南的产量很高,具有很高的经济价值。据报道,美味牛肝菌营养价值很高[1],富含多糖等功能性物质[2],能增强机体免疫力,具抗肿瘤、抗突变、降血脂、抗病毒等功效。然而,近年来环境重金属污染日益严重,美味牛肝菌对镉具有很强的生物富集能力和耐受性[3]。本项目组对云南省野生食用菌重金属含量的初步调研,也发现了很多镉含量超过国家限量标准的美味牛肝菌样本,个别菌株镉含量达到7.35 mg/kg DW,虽然远远低于Collin-Hansen等[4]报道的由挪威锌矿区采集的美味牛肝菌中的126 mg·kg-1DM,但是具有潜在的食品安全隐患。

美味牛肝菌对镉的富集,一方面影响了其食品安全性,需要对其进行有效的质量和安全控制;另一方面,提示可探索对重金属具有高富集能力和耐受性的蕈菌,在环境的生物治污方面具有重要意义。因此,需要研究美味牛肝菌对镉的生物富集特性,为上述两点的研究提供理论基础。研究表明,重金属胁迫下,植物和真菌的首要防御系统是胞壁多糖、一些金属结合蛋白、及其抗氧化酶系等[5]。美味牛肝菌对镉的生物富集机制可能也与菌体内的特定成分及其抗氧化酶系有关。目前尚未见此类的研究报道。本项目在实验室可控培养条件下,针对镉(Ⅱ)(Cd2+)对美味牛肝菌菌丝体液体发酵性能及其主要成分含量的影响,以及菌丝体对Cd2+的生物富集性能进行了研究。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

美味牛肝菌(Boletusedulis) 购于中科院微生物菌种保藏中心,PDA培养基(马铃薯20%,葡萄糖2%,琼脂2%,pH自然)活化。实验用水为超纯水;镉元素标准溶液(1000 μg/mL) 购于国家有色金属及电子材料分析测试中心;过氧化氢酶(CAT)测定试剂盒(可见光法)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)测试盒(羟胺法)、过氧化物酶(POD)测定试剂盒(紫外法) 购于南京建成生物工程研究所;琼脂和葡萄糖,生物培养用试剂 购于sigma;其它为分析纯试剂。

YXQ-LS-30SH型立式压力蒸汽灭菌器 上海博讯实业有限公司;SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台 江苏净化设备有限公司;QYC-2012C震荡培养箱 宁波江南仪器厂;TU-1901双光束紫外可见光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;AAS400G型原子吸收光谱仪 德国耶拿;3k15型冷冻离心机 德国sigma。

1.2 实验方法

1.2.1 美味牛肝菌实验室的可控培养 制备PDA液体培养基,灭菌,接活化菌种,27 ℃、180 r/min条件下振荡培养3 d,得种子液。

根据本研究预实验得到的菌丝生长半数抑制率的Cd2+浓度,设置培养基中Cd2+浓度为0、16、32、48、64、80 mg/L。将制备好的种子液打碎,按3%接种量接种于Cd2+浓度为0、16、32、48、64、80 mg/L的250 mL的三角瓶中(每个三角瓶装液量100 mL PDA液体培养基),重复6次,27 ℃、180 r/min振荡培养5 d,抽滤,大量超纯水冲洗后,每瓶菌丝体发酵生物量以冻干后的重量计。得到的菌丝体分为2组,一组直接用于胞内抗氧化酶系活性分析;另一组真空冷冻干燥,称量菌丝干重,研碎,保存于干燥器备用。

1.2.2 菌丝体中镉元素含量测定 参考GB/T 5009.15-2003《食品中镉的测定的方法》,测定冻干后菌丝体中镉含量。

1.2.3 菌丝体中可溶性总糖含量测定及菌丝体多糖含量分析 准确称取冻干的菌丝体20 mg,加入5 mL水,90 ℃震荡提取2 h,3500 r/min离心10 min,取上清;沉淀加5 mL水重复提取一次,离心合并上清液,定容,采用苯酚-硫酸法测定菌体可溶性总糖含量,0～100 μg/mL的葡萄糖制作标准曲线[6]。

准确称取冻干的菌丝体10 g,加入100 mL水,90 ℃震荡提取2 h,3500 r/min离心10 min,取上清;沉淀加100 mL水重复提取一次,离心合并上清液,旋转蒸发浓缩至一定体积后加入4倍体积无水乙醇,4 ℃醇沉过夜,5000 r/min离心10 min,取沉淀复溶至一定体积后Savage法除蛋白,取水层冻干,得到菌丝体多糖提取物,复溶至一定体积后采用苯酚-硫酸法测定菌体多糖含量,0～100 μg/mL的葡萄糖制作标准曲线[6]。

1.2.4 菌丝体中CAT、SOD、POD活性及可溶性蛋白含量测定 准确称取3 g新鲜菌丝,按1∶3的比例加入0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH7.0),一小勺石英砂,冰浴研磨匀浆,4 ℃冷冻离心(3500 r/min,10 min),取上清液作为CAT、SOD、POD活性及可溶性蛋白质含量的待测液。

1.2.5 数据统计方法 每个实验至少六次重复,测定结果表达为平均值±标准偏差。使用Microsoft Office Excel 2007和origin7.5进行数据处理、作图及回归分析。采用SPSS11.5软件对数据进行方差分析,差异显著性水平为α=0.05。

2 结果与讨论

2.1 Cd2+对美味牛肝菌菌丝生长的影响

镉(Ⅱ)对美味牛肝菌菌丝体生长发育的影响如图1所示。在无Cd2+培养基中,美味牛肝菌长势很好,滤出的菌丝体色白,呈明显且均匀的丝状。不同浓度Cd2+处理显著抑制了美味牛肝菌菌丝体的生长发育(p<0.05),且滤出的菌丝体随Cd2+浓度的增加颜色呈淡黄至黄褐色。这可能是Cd2+胁迫下,美味牛肝菌菌丝产生了黑色素,来螯合菌体中的Cd2+,提高菌丝体对Cd2+的耐受性[7]。培养结束后,无Cd2+培养基平均每瓶菌丝发酵产量为0.65 g,随着Cd2+的加入,菌丝发酵产量逐渐减少,如图1所示,本研究与前期研究结果一致[8]。将Cd2+处理浓度(X)与美味牛肝菌菌丝体发酵产量(Y)进行回归分析得到Y=-0.0048X+0.592(R2=0.9283),即Cd2+对菌丝体生长发育的抑制作用与其浓度线性正相关,生长抑制率为50%的Cd2+浓度为56 mg/L,表明美味牛肝菌对Cd2+具有较高的耐受性。

图1 Cd2+对美味牛肝菌菌丝体生长发育的影响Fig.1 Effect of Cd2+ on the growth of Boletus edulis注：标注不同字母表示差异显著(p<0.05)，图2～图4同。

2.2 菌丝体对Cd2+的生物富集作用

如图2所示,不同浓度Cd2+的液体培养基中,美味牛肝菌菌丝体对Cd2+的生物富集量呈“S”形曲线变化。由图2可以看出,随着培养基中Cd2+浓度的增加,菌丝体对Cd2+的富集量快速上升,其富集系数在Cd2+添加较低浓度时(16 mg/L)达到第一个峰值,为48.8,菌丝对Cd2+的富集量为780.2 mg/kg DW。在培养基中Cd2+浓度为64 mg/L时,菌丝体对Cd2+的富集量达到最大值,为3335.7 mg/kg DW,其富集系数也达到最大值,为52.1,其后,随培养基中Cd2+浓度的增加,菌丝体对Cd2+的吸附量不再显著增加,即达到饱和吸附,吸附量为3408.9 mg/kg DW。

根据目前的一些研究,大型真菌在活体生长过程中,菌丝体对培养基质中重金属的生物吸附性能显著高于子实体[3,7],但是远远低于将采获后的子实体作为生物吸附剂对基质中重金属的生物吸附能力[9]。这可能是菌丝体作为子实体的营养体,其与重金属结合的大分子物质,如多糖、蛋白等含量较高;但是活体培养最终会受到重金属损伤而产生体内重金属平衡机制,使其对重金属的生物吸附具有较低的饱和度。但是以采获后子实体作为生物吸附剂,处理基质中的重金属不再受活体的重金属生理平衡机制的影响,从而具有较高的吸附饱和度。

图2 美味牛肝菌菌丝发酵对培养基中Cd2+的生物富集性能Fig.2 Accumulation capacity and bioconcentration factor(BCF)of Cd2+ in Boletus edulis

2.3 Cd2+对菌丝体中可溶性总糖、可溶性蛋白含量及菌体多糖含量的影响

不同浓度Cd2+处理显著影响了美味牛肝菌菌丝体中可溶性总糖、可溶性蛋白和菌体多糖的含量(p<0.05),如图3所示。美味牛肝菌菌体中可溶性总糖含量较高,无Cd2+培养的菌丝体中达到25.3% DW;随着Cd2+的加入及其浓度的增加,菌体中可溶性总糖含量呈现先增加后降低的趋势,在Cd2+浓度为16 mg/L时,菌体中可溶性总糖含量最高(p<0.05),为33.9% DW,Cd2+浓度为80 mg/L时菌体总糖含量则显著降低为18.4% DW(p<0.05)。

Cd2+处理对菌体中可溶性蛋白含量的影响与总糖完全相反,由图3可以看出,随Cd2+浓度的增加,菌体中可溶性蛋白含量呈现先降低后增加的趋势,即Cd2+浓度为16 mg/L时菌体中可溶性蛋白含量最低(p<0.05),为0.9 mg/g FW;Cd2+浓度为80 mg/L时菌体可溶性蛋白含量显著增加为1.6 mg/g FW(p<0.05),相比较于无Cd2+组的1.0 mg/g FW,增加了1.6倍。

Cd2+处理对菌体中多糖含量的影响也呈现先增加后降低的趋势,相对于可溶性总糖含量,菌体多糖在48 mg/L Cd2+处理时含量最高,为3.9% DW。无Cd2+添加时,菌丝体中多糖含量最低,为2.4% DW,所以培养基中Cd2+的存在刺激了美味牛肝菌菌体多糖的合成。

菌体中可溶性糖类主要包括葡萄糖、果糖、麦芽糖以及能够在测定条件下水解为单糖的可溶性低聚糖,是菌体细胞中的主要能量物质和渗透调节物质,可以直接参与菌丝体的新陈代谢,从营养学角度,也是菌体供给人体的主要营养物质和功能性成分;而多糖成分中一部分是菌体的初级代谢产物,一部分是次级代谢产物。重金属对真菌可溶性总糖含量的影响未见报道,程显好等[10]研究发现锌对蛹虫草菌体中葡萄糖含量的影响呈先增后降的趋势,锌处理量很高时菌体葡萄糖的含量要显著低于无锌组;王松华等[11]发现高浓度镉处理显著降低了灵芝菌丝体中还原性糖含量。可能在金属毒害作用下,菌体生长发育受到抑制,从而抑制了菌体的新陈代谢进程。对此作用机理还有待进一步研究。

菌体多糖如几丁质、纤维素、纤维素衍生物等细胞成分能结合菌体吸附的重金属,对菌体抗金属胁迫的耐受性具有显著积极作用[7]。另一方面,菌体多糖一般具有显著的抗氧化活性,可有效清除自由基,维持细胞氧化压力的平衡。重金属存在下,可以刺激胞内产生过多的活性氧,增加细胞氧化压力,对细胞产生毒害。推测,Cd2+刺激美味牛肝菌菌体多糖的合成有助于平衡胞内氧压。所以,金属离子的存在一般可以刺激菌体多糖的合成。

重金属胁迫下,所有的生命体都存在生物转化来降低重金属的毒性,如诱导产生金属硫蛋白、胁迫蛋白来螯合、稳定进入体内的重金属。本研究中,Cd2+处理浓度较高,梯度跨度大,没有观察到低剂量的Cd2+对可溶性蛋白的诱导效应,所以可溶性蛋白呈现了先降后增的变化趋势。对于很高浓度Cd2+处理刺激菌体中可溶性蛋白含量的增加,其机理还有待于进一步研究。

图3 Cd2+对美味牛肝菌菌丝体中可溶性总糖、可溶性蛋白及菌体多糖含量的影响Fig.3 Effects of Cd2+ on the total soluble saccharides,soluble protein and polysaccharides

2.4 Cd2+对菌丝体中CAT、SOD、POD活力的影响

不同浓度Cd2+处理显著影响了美味牛肝菌菌丝体中CAT、SOD和POD的活性(p<0.05),如图4所示。CAT和SOD活性随Cd2+处理浓度的增加呈现显著的“低促高抑”变化(p<0.05),Cd2+浓度为16 mg/L时CAT和SOD活性均达到最大值。对于CAT活性,Cd2+处理浓度高于16 mg/L以后,其活性均显著低于无Cd2+组(p<0.05);对于SOD活性,Cd2+处理浓度高于32 mg/L以后,其活性维持于无Cd2+处理组相当;POD活性被Cd2+显著抑制(p<0.05)。

镉胁迫可使生物细胞活性氧水平升高,造成活体细胞的氧压损伤。生物细胞内的CAT、SOD、PPO等抗氧化酶系可在一定程度上平衡各种环境因子造成的氧化迸发,降低氧压损伤,提高生物体抗逆性。重金属作为生物体不利的环境因子之一,其胁迫下一般可刺激生物体抗氧化酶系活性升高,清除过量的活性氧,先前研究[11-12]先后报道了镉胁迫下灵芝、柱状田头菇等真菌菌丝体中抗氧化酶系的响应,均可发现较低镉浓度处理时对菌体抗氧化酶系的激活作用。推测,菌体抗氧化酶系活性升高,协同可溶性蛋白、菌体多糖等可提高菌体对重金属胁迫的耐受性能。本研究中POD活性随Cd2+处理的显著降低,可能是本研究中Cd2+处理浓度太大,没有观察到Cd2+处理对POD活性的激活作用。

图4 Cd2+对美味牛肝菌菌丝体中CAT、SOD和POD活性的影响Fig.4 Effects of Cd2+ on the activities of CAT,SOD and POD

3 结论

目前对于生物的金属离子富集甚至超富集作用机制还不完全了解。从本文和已有研究来看,大型真菌对重金属具有一定的生物富集作用和耐受性。

菌体中特定的物质成分,如多糖、菌体蛋白等可参与重金属的吸附,对重金属胁迫造成的氧化压力损伤具有一定的修复作用。菌体中的抗氧化酶系可被重金属胁迫激活,协同菌体多糖和蛋白等提升菌体对重金属的耐受性能。重金属胁迫下大型真菌抗性机理是十分复杂的,其耐受性能可能是由多个基因调控,还需从细胞、分子水平上作进一步研究。

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Bioconcentration characteristics of Cadmium(Ⅱ)byBoletusedulis

LI Jin-cheng,BAO Chang-jun,SUN Yun,ZHUANG Yong-liang*,SUN Li-ping

(Yunnan Institute of Food Safety,Kunming University of Science and Technology,Kunming 650500,China)

The bioconcentration characteristics of cadmium(Ⅱ)with different concentrations(Cd2+,0,16,32,48,64 and 80 mg/L)byBoletusedulisunder liquid fermentation were investigated. The results showed that the treatment with increasing Cd2+concentrations significantly inhibited mycelia growth(p<0.05),and 50% inhibitory concentration was 56 mg/L. Mycelia showed significant accumulation capacity for Cd2+,with the highest content of 3335.7 mg Cd per kg mycelia(DW),and the bioconcentration factor was 52.1(p<0.05). The contents of total soluble sugars and polysaccharides in mycelia were increased firstly and then decreased with increasing Cd2+concentrations. The content of polysaccharides in mycelia treated with Cd2+significantly higher than that of control(p<0.05). Soluble protein contents were decreased firstly and then increased with increasing Cd2+concentrations,with the peak at 80 mg/L Cd2+(p<0.05). The activities of CAT and SOD were significantly increased by lower Cd2+concentrations but inhibited by high Cd2+concentrations(p<0.05). The activities of POD were significantly inhibited by Cd2+treatment(p<0.05).

Boletusedulis;cadmium;bioconcentration;food safety

2015-03-16

李金城(1989-)，男，硕士研究生，研究方向：食品营养与安全，E-mail：340198516@qq.com。

*通讯作者:庄永亮(1981-)，男，博士，教授，主要从事食品高值化利用及质量控制研究，E-mail：kmylzhuang@163.com。

国家自然科学基金项目(21267013)。

TS201.2

A

1002-0306(2015)23-0068-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.23.005