响应面法优化异硫链霉菌LMZM利用玉米芯粉产木聚糖酶发酵培养基的研究

罗 玲,蔡 俊,王常高,杜 馨,林建国

(湖北工业大学发酵工程教育部重点实验室和工业发酵湖北省协同创新中心,湖北武汉 430068)

响应面法优化异硫链霉菌LMZM利用玉米芯粉产木聚糖酶发酵培养基的研究

罗 玲,蔡 俊*,王常高,杜 馨,林建国

(湖北工业大学发酵工程教育部重点实验室和工业发酵湖北省协同创新中心,湖北武汉 430068)

本研究采用响应面法对异硫链霉菌LMZM产木聚糖酶的发酵培养基进行优化。首先利用Plackett-Burman实验设计筛选出影响产酶的4个显著性因素:玉米芯粉、大豆粉、酵母粉和MgSO4。在此基础上,研究不显著因素的最低添加量来降低生产成本,然后运用最陡爬坡法逼近最大响应值区域,最后利用中心复合设计确定显著性因素之间的交互作用及最佳组成。结果表明,玉米芯粉27.85 g/L、大豆粉16.25 g/L、酵母粉3.46 g/L、MgSO41.18 g/L、K2HPO40.60 g/L、Na2HPO40.40 g/L,木聚糖酶最大理论酶活可达117.80 U/mL,经3次平行实验验证,实际酶活平均值为116.63 U/mL与预测酶活相近,且比优化之前的酶活提高了1.28倍。

木聚糖酶,异硫链霉菌,响应面法,培养基优化,玉米芯粉

木聚糖(XyLan)作为半纤维素的主要组成成份,也是植物细胞壁的重要组成成份,是自然界中仅次于纤维素的多糖,在植物中的总含量大约占1/3左右[1-3]。木聚糖作为重要的可再生资源,广泛的存在于玉米芯、米糠、甘蔗渣、秸秆、麦麸等农副产品中,但难以得到充分的利用。此外,在造纸制浆工业中富含木聚糖废料的再利用率低,通常直接排入水中,导致水质富营养化,严重破坏生态环境,在我国此现象尤为突出[4]。木聚糖酶是指能够降解木聚糖成低聚木糖和木糖的一组酶系的统称,主要包括β-1,4-外切木聚糖酶,β-1,4-内切木聚糖酶和β-木糖苷酶[5]。由于部分链霉菌菌株能产生较高活性的木聚糖酶,且酶比较单一,纤维素酶活较低,有较高的工业应用价值,因此近年来被广泛关注[6]。目前,国内外对异硫链霉菌产木聚糖酶能力的研究较少,有待进一步发掘。同时,木聚糖酶在食品、纺织、饲料和造纸工业等方面都具有广阔的用途[7]。

目前,用于优化发酵条件的数学统计方法主要为单因素法、正交实验法和响应面分析法。李家群等采用单因素和正交实验研究用稻草粉在最佳条件下发酵培养链霉菌LH-3,木聚糖酶活力最高为120.30 U/mL[8]。单因素法无法得知因素之间的交互影响,正交实验只能得到最佳因素水平组合[9]。而响应面分析则可以有效、经济的方式更为合理的实验设计方案,考虑实验的随机误差,对实验进行全面的分析[10]。Coman,G.等以Streptomycessp.P12-137利用中心复合实验研究以小麦麸皮作碳源产木聚糖酶的情况,其酶活为27.77 UA/mL[11]。Zhicai Zhang等以Rhizopusstolonifer利用中心复合实验研究以玉米芯作碳源产木聚糖酶的情况,其酶活为13.90 U/g[12]。

本研究旨利用响应面分析方法对异硫链霉菌LMZM利用农业废弃物玉米芯粉产木聚糖酶的发酵培养基成分进行初步优化,提高酶活同时,降低原料成本,减少环境污染,为进一步的放大研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

异硫链霉菌LMZM 实验室筛选保藏;种子培养基(g/L) 可溶性淀粉20、KNO31.0、K2HPO40.5、MgSO4· 7H2O 0.5、NaCl 0.5、FeSO4· 7H2O 0.01;发酵培养基(g/L) 玉米芯粉 24.4、大豆粉16、KNO38、K2HPO40.4、Na2HPO40.754、MgSO4· 7H2O 0.4;斜面保藏培养基(g/L) 可溶性淀粉20、KNO31.0、K2HPO40.5、MgSO4· 7H2O 0.5、NaCl 0.5、FeSO4· 7H2O 0.01,琼脂粉20。

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1.2 培养条件

发酵周期108 h,发酵温度40 ℃,接种量8%,初始pH5.5,装液量50 mL/250 mL三角瓶,摇床转速为160 r/min。

1.3 木聚糖酶活力的测定

DNS法测定还原糖(以木糖为标准品):发酵液8000 r/min离心10 min,所得上清液即为粗酶液。粗酶液稀释适当倍数,取1.5 mL 1%木聚糖溶液加入25 mL比色管,加0.5 mL适当稀释的粗酶液后置于60 ℃水浴中反应10 min,加入3 mL DNS溶液,其混合物在沸水浴中加热10 min后,立即冷却至室温,定容至25 mL,540 nm波长下测定吸光值,对照用灭活酶液代替粗酶液。用木糖作标准曲线,吸光值经曲线对比得出木糖含量后计算木聚糖酶活力[13-14]。木聚糖酶酶活力单位定义为每分钟催化产生1 μmol木糖所需要的酶量。

1.4 实验设计

1.4.1 Plackett-Burman设计 Plackett-Burman设计是以最少实验次数找到对木聚糖酶活有显著性影响的因素(可信度大于95%的因素作为主效应)的实验方法。对于N次实验至多可研究(N-1)个因素,每个因素取两个水平:高水平和低水平[15]。通过该设计进行实验,筛选出显著性因素进行下一步的实验。根据前期的单因素实验结果,实验选取的因素共有8个,虚拟项3个,每个因素取2个水平,Plackett-Burman实验设计的各因素和水平,见表1。

表1 Plackett-Burman设计各因素与水平

1.4.2 最低添加量实验 在PLackett-Burman实验设计得出不显著因素基础上,以培养基最节省为目的研究不显著因素的最低添加量,依据各因素效应合理设计变化步长,设计最低添加量实验表头,进行实验。

1.4.3 最陡爬坡实验 在PLackett-Burman实验设计得出的显著性因素后,对其最佳值区域进行进一步确定的实验方法。找到拐点,为后续的中心复合设计提供实验依据。根据显著性因素效应值确定变化步长,近一步靠近最佳值区域。根据Plackett-Burman实验的结果,做最陡爬坡实验。

1.4.4 Central composite design(CCD)设计 以爬坡设计得出的实验结果为依据进行CCD设计,见表2,用软件Design expert 8.0.6对实验进行实验设计回归分析,确定显著性因素的最佳添加量,依据回归方程绘制响应面三维立体分析图。

表2 中心复合设计各因素与水平

1.5 验证实验

用2.4中心复合设计实验结果的培养基组成预测值进行3次平行实验,摇瓶发酵培养测定酶活,酶活取平均值,以验证模型是否可靠,进而确定最终优化培养基组成。

表4 Plackett-Burman 设计回归分析

注:*α=0.05。

2 结果与分析

2.1 Plackett-Burman设计

Plackett-Burman实验结果见表3。从Plackett-Burman 设计回归分析(表4)看出,该回归模型的p值(prob>F)为0小于0.05,则该模型在95%的置信区间内显著。玉米芯粉、大豆粉、酵母粉和MgSO4的p值分别为0.004、0.030、0.027和0.042,均小于0.05,则玉米芯粉、大豆粉、酵母粉和MgSO4在95%的置信区间内显著,而K2HPO4、Na2HPO4、NaH2PO4和CaSO4的p值分别为0.160、0.413、0.101和0.180,均大于0.05,则K2HPO4、Na2HPO4、NaH2PO4和CaSO4在95%的置信区间内不显著。其决定系数R2=0.7836说明回归方程可以解释高达78.36%的实验数据。

2.2 最低添加量实验

根据PLackett-Burman实验,由于R2=0.7836<0.9，因此为了进一步提高数据的准确度，对不显著因素K2HPO4、NaH2PO4、NaH2PO4和CaSO4做最低添加量实验。

由图1A知,随着NaH2PO4添加量的增加,木聚糖酶活逐渐减小,当添加量为0 g/L时,木聚糖酶活最高,为90.97 U/mL;由图1B知,随着CaSO4添加量的增加,聚糖酶活逐渐减小,当添加量为0 g/L时,木聚糖酶活最高,为90.97 U/mL;由图1C知,Na2HPO4木聚糖酶活逐渐增大,当添加量为0.40 g/L,木聚糖酶活最高,为93.17 U/mL;由图1D知,随K2HPO4添加量的增加,木聚糖酶活逐渐增大,当添加量为0.60 g/L时,木聚糖酶活最高,为93.83 U/mL。故选择NaH2PO4、CaSO4、Na2HPO4和K2HPO4的添加量分别为0、0、0.40、0.60 g/L。

图1 最低添加量的实验设计与结果Fig.1 The design and result of minimum amount

2.3 最陡爬坡实验

为了进一步提高木聚糖酶活,寻求发酵培养基的最优组合,根据PLackett-Burman实验的回归分析和方差分析,玉米芯粉和MgSO4为正效应,则说明随着添加量水平逐步升高,木聚糖酶活也会得到提高。反之,大豆粉、酵母粉为负效应,说明随着其添加水平的逐步降低,木聚糖酶活将会得到提高。据此,设计了最陡爬坡实验,见表5。

表3 Plackett-Burman 设计及结果

表5 最陡爬坡实验设计及结果

由表5知,第3组木聚糖酶活最高,即玉米芯粉、大豆粉、酵母粉和MgSO4的用量分别为35、15、6和1.4 g/L时,酶活为110.52 U/mL,随着运行序的进一步增加,木聚糖酶活逐渐降低。故选择玉米芯粉、Na2HPO4的添加量分别为35、15、6和1.4 g/L作为中心复合设计的原点。

2.4 中心组合实验设计(Central composite design)

2.4.1 模型的建立及显著性检验 根据中心组合实验设计原理,根据上述实验结果,设计玉米芯粉、大豆粉、酵母粉和MgSO4进行中心复合实验,每个因素选5个水平,以木聚糖酶活力为响应值作响应面设计,实验设计的各因素和水平,见表2。6个中心点、30次实验设计及结果和预测见表6。

表6 中心复合设计及结果

由响应面的回归分析(表7)知,模型的p值(prob>F)小于0.05,说明模型具有显著性,该二次模型多元相关性系数R2(预测)=0.9713,明预测仅有2.87%的变异情况不能由该模型解释,失拟项p值为0.1076 表明失拟项不显著,模型没有失拟现象。X1、X2、X4对酶活的影响显著,X1X2、X1X3、X1X4、X2X4、X3X4的交互影响显著,X12、X22、X32、X42对酶活的影响均显著。

通过二次模型回归系数的计算,得到如下方程以表征4个因素对木聚糖酶活力的影响:

表7 中心复合设计回归分析

Design Expert 8.0.6分析解得最优值点为X1=-1.43,X2=0.50,X3=-1.27,X4=-1.12即质量浓度分别为玉米芯粉27.85 g/L、大豆粉16.25 g/L、酵母粉3.46 g/L、MgSO4为1.18 g/L,预测最大酶活117.80 U/mL。

2.4.2 响应面显著性交互作用图分析 根据预测公式建立显著性交互作用的三维立体图,观察其对木聚糖酶活的影响。

图2 玉米芯粉和大豆粉的交互作用对木聚糖酶酶活影响的响应面图Fig.2 Response surface for interaction effects of corncob and soybean on xylanase activity

由图2知,当玉米芯粉质量浓度较高时,大豆粉对木聚糖酶的产生没有显著性影响,同时玉米芯粉编码水平取0水平附近时,木聚糖酶活较高。图3知,当玉米芯粉和酵母粉的编码水平分别从-0.2到0.5、从0到0.8之间时,木聚糖酶的酶活皆高于100 U/mL。由图4知,编码水平取0水平附近时,木聚糖酶活较高。由图5知,当大豆粉和MgSO4的编码水平分别从-0.4到0.5、从-0.5到0.2之间时,木聚糖酶的酶活皆高于102 U/mL。由图6知,当酵母粉粉和MgSO4的编码水平分别从-0.3到0.7、从-0.5到0.5之间时,木聚糖酶的酶活皆高于104 U/mL。

图3 玉米芯粉和酵母粉的交互作用对木聚糖酶酶活影响的响应面图Fig.3 Response surface for interaction effects of corncob and yeast extract on xylanase activity

图4 玉米芯粉和硫酸镁的交互作用对木聚糖酶酶活影响的响应面图Fig.4 Response surface for interaction effects of corncob and MgSO4 on xylanase activity

图5 大豆粉和硫酸镁的交互作用对木聚糖酶酶活影响的响应面图Fig.5 Response surface for interaction effects of soybean and MgSO4 on xylanase activity

图6 酵母粉和硫酸镁的交互作用对木聚糖酶酶活影响的响应面图Fig.6 Response surface for interaction effects of yeast extract and MgSO4 on xylanase activity

2.5 验证实验

用CCD设计得到的最佳培养基组成:玉米芯粉27.85 g/L、大豆粉16.25 g/L、酵母粉3.46 g/L、MgSO41.18 g/L、K2HPO40.60 g/L、Na2HPO40.40 g/L作3次重复验证性实验,酶活平均值为116.63 U/mL。实测值与回归方程预测值(117.80 U/mL)吻合良好,由此可见,用该回归模型优化Streptomyces althioticus LMZM 木聚糖酶的培养成分是可行的,且具有实用价值。此外,与培养基优化前的最大酶活力(51.73 U/mL)相比,提高了1.28倍。

3 结论

本研究从各种土样中筛选出木聚糖酶生产菌株异硫链霉菌LMZY,利用响应面法对其液体发酵产酶培养基成分进行优化,培养基组成:玉米芯粉27.85 g/L、大豆粉16.25 g/L、酵母粉3.46 g/L、MgSO41.18 g/L、K2HPO40.60 g/L、Na2HPO4为0.40 g/L,最高产酶活力可达116.63 U/mL,与理论最大酶活力117.80 U/mL 接近,说明运用响应面法优化异硫链霉菌LMZM产木聚糖酶是合理可靠的,且酶活力比培养基成分优化前提高1.28倍。同时,本文以廉价的农业废弃物玉米芯为碳源,未经化学药品处理直接发酵产酶,大大降低预处理和原料成本,减少环境污染,具有环保及经济的双重效益。

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Study on optimization of culture medium for xylanase production by Streptomyces althioticus LMZM using response surface methodology with corncob

LUO Ling,CAI Jun*,WANG Chang-gao,DU Xin,LIN Jjian-guo

(Key Laboratory of Fermentation Engineering(Ministry of Education),Hubei Provincial Cooperative Innovation Center of Industrial Fermentation,Hubei University of Technology,Wuhan 430068,China.)

In this study,response surface methodology(RSM)was employed to optimize a fermentation medium for the production ofStreptomycesalthioticusLMZM in submerged fermentation with corncob as substrate. Four significant influence factors including corncob powder,soybean,yeast extract powder and magnesium sulfate were screened by the method of Plackett-Burman design. In addition,the minimum addition amount experiment was used for finding out the minimum add amount of non-significant factors to reduce the source cost. The steepest ascent design was applied to approach the optimal region of the three significant factors. And the optimal concentration and correlations among three factors were identified by central composite design. The optimal fermentation parameters for enhanced xylanase production were found to be corncob powder 27.85 g/L,soybean 16.25 g/L,yeast extract powder 3.46 g/L,magnesium sulfate 1.18 g/L,potassium phosphate dibasic 0.60 g/L and disodium hydrogen phosphate 0.40 g/L. The model predicted a xylanase activity of 117.80 U/mL. After three parallel verifications,the maximum theoretic value was consistent with mean value of verification test which was 116.63 U/mL,and the xylanase production was increased by 1.28-fold in comparison with to that before optimization

xylanase;Streptomycesalthioticus;RSM;medium optimization;corncob

2015-02-13

罗玲(1990-),女,硕士,研究方向:发酵过程优化与放大,E-mail:jkrjll@live.com。

*通讯作者:蔡俊(1968-),男,博士,教授,研究方向:发酵过程优化与放大,E-mail:hgcaijun@126.com。

TS201.2

B

1002-0306(2015)23-0266-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.23.046