无糖发酵红豆乳乳酸菌的筛选及驯化

王 丽,董英丽,双 全

(内蒙古农业大学食品科学与工程学院,内蒙古呼和浩特 010018)

无糖发酵红豆乳乳酸菌的筛选及驯化

王 丽,董英丽,双 全*

(内蒙古农业大学食品科学与工程学院,内蒙古呼和浩特 010018)

以从内蒙古传统发酵食品中分离的50株乳酸菌为对象,在无糖LB培养基进行初筛的基础上,于红豆乳中以产酸能力和蛋白质分解能力为目标值进行复筛,再对筛选出的菌株进行驯化。结果表明,50株供试乳酸菌经初筛获得3株生长状况较好的菌株S2-4、Sc8-1和NM-6。复筛结果表明NM-6在红豆乳中37 ℃培养48 h时其总酸度和游离氨基氮含量分别达到0.27%和1.215 mmol/L。再对菌株NM-6进行驯化后,其总酸度和游离氨基氮含量比驯化前分别提高了59.3%和25.3%。驯化后的菌株在红豆乳中有更好的适应性,增强了菌株的活力,从而有助于提高酸豆乳产品的质量。

乳酸菌,无糖培养基,红豆乳,驯化,筛选

红豆是一种高蛋白、低脂肪、多营养的功能食品[1],其蛋白质含量比禾谷类物质高2～3倍,且含有人体必需的8种氨基酸[2]。红豆中还富含膳食纤维,可通过降低葡萄糖在体内的吸收速度来维持餐后血糖的稳定,是糖尿病患者食用的理想主食之一[3]。此外红小豆提取物具有显著的抗氧化、降高血压、降胆固醇等作用[4-5]。据报道,发酵后的红豆乳营养价值提高并更易于人体吸收[6]。本实验为了充分发挥红豆乳固有的营养价值及乳酸菌的益生功能[7],以从内蒙古传统发酵食品中分离的乳酸菌为对象,在无糖LB培养基和红豆乳中以产酸能力和蛋白质分解能力为指标进行筛选,并对其进行驯化。以使菌株能更好的适应在红豆乳中生长。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

市售红豆;供试乳酸菌50株(全部乳酸菌来自内蒙古农业大学实验室提供,从酸菜、奶酪、马奶酒等传统发酵食品中分离并初步鉴定的并经编号的菌株)。

MRS液体培养基:大豆蛋白胨10 g/L、牛肉膏10 g/L、酵母提取粉5 g/L、柠檬酸氢二铵2 g/L、无水乙酸钠5 g/L、磷酸氢二钾2 g/L、Tween 80 1 g/L、硫酸镁200 mg/L、硫酸锰54 mg/L、无水葡萄糖20 g/L,pH6.5,121 ℃ 20 min灭菌。

LB培养基:胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L,121 ℃ 20 min灭菌。

SW-CJ-2FD洁净工作台 上海大龙医疗设备有限公司;HVE-50全自动立式高压灭菌器HIRAYAMA;电热恒温培养箱 上海一恒科学仪器有限公司;Thermo CR3i冷冻型多功能离心机、TU-1810紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司。

1.2 实验方法

1.2.1 红豆乳的制备:挑选新鲜、饱满、无虫蛀的红豆进行搓洗,彻底清除附在豆子表面上的脏污,以干净清水充分冲洗几次。然后按红豆∶水=1∶4浸泡红豆,水温30～35 ℃,浸泡时间12 h,用少许5% NaHCO3溶液调浸泡液的pH至7.5～8.5,用豆浆机将浸泡好的红豆榨汁,制成浓度为4%的红豆乳,105 ℃灭菌15 min后,然后冷却至4 ℃备用接菌[8]。

1.2.2 无糖发酵红豆乳乳酸菌的筛选

1.2.2.1 乳酸菌在无糖LB培养基中的初筛 将经活化好的供试乳酸菌50株,接种于无糖的LB培养基中37 ℃恒温培养24 h,根据其生长能力OD值的测定初步筛选出优势乳酸菌。

1.2.2.2 乳酸菌在红豆乳中的复筛 将初筛乳酸菌按2%接种量分别接种于浓度为4%的新鲜红豆乳中,于37 ℃恒温培养48 h,同时将未接菌的4%的红豆乳置于同样的条件下37 ℃恒温培养48 h作为对照组,分别测定0、24、48 h时其总酸度和游离氨基氮含量,从中选出产酸能力和蛋白质分解能力较强的菌株。总酸度测定参照GB 5413.34-2010《食品安全国家标准乳和乳制品酸度的测定》方法[9]。游离氨基氮测定采用OPA试剂法[10-13]。

1.2.3 筛选菌株的驯化 将筛选乳酸菌在不同比例的LB培养基和红豆乳的混合培养基中于37 ℃恒温培养24 h进行驯化[14-15](LB培养基∶红豆乳=10∶0;8∶2;5∶5;2∶8),驯化后接入红豆乳中37 ℃培养48 h,通过测定0、8、16、24、32、48 h不同时间段内红豆乳的总酸度和游离氨基氮含量,比较筛选菌株驯化前后其产酸能力和蛋白质分解能力的变化。

1.2.4 数据处理 实验数据用SPSS19.0进行处理,用Excel作图。

2 结果与分析

2.1 无糖发酵红豆乳乳酸菌的筛选

2.1.1 供试乳酸菌在无糖LB培养基中的生长能力 结果表明绝大部分乳酸菌在无糖LB培养基中于37 ℃培养24 h后的OD值都小于0.50,只有3株乳酸菌S2-4、Sc8-1和NM-6的OD值大于0.50,其OD值对应分别为0.568、0.502、0.538(结果过多未出示)。

2.1.2 筛选菌株在红豆乳中的产酸能力 将初筛的3株菌接种于红豆乳中,与对照组相比37 ℃培养不同时段内的总酸度含量测定结果见表1。

由表1可知,3株菌在发酵红豆乳中随着发酵时间的延长其总酸度比对照组明显增高,其中菌株NM-6的产酸能力相对较强,在37 ℃培养48 h时的总酸度可达到0.27%,是发酵前的5.4倍。发酵0 h和24 h时的总酸度之间差异显著(p<0.05),而发酵24 h和48 h时其总酸度之间差异不显著(p>0.05)。由显著性分析可得该菌在发酵24 h以内的酸度增长要明显高于24 h以后时段,说明菌株NM-6的生长对数期在发酵24 h以内出现。

表1 筛选菌株在不同培养时间的总酸度(x±sd,n=6)

注:同行肩标不同小写字母表示差异显著(p<0.05),相同字母为差异不显著(p>0.05),表2、表3同。

2.1.3 筛选菌株在红豆乳中的蛋白质分解能力 根据OPA试剂法,由L-苯丙氨酸标准溶液的浓度及其吸光度值制作的标准曲线见图1。以标液的浓度对吸光度值(OD值)进行直线回归,得出回归方程为y=0.4641x-0.0089,R2=0.9979。

图1 L-苯丙氨酸标准曲线Fig.1 The standard curve of L-phenylalanine

将初筛的3株菌接种于红豆乳中,37 ℃培养不同时段内的游离氨基氮含量测定结果见表2。

表2 筛选菌株在不同培养时间的游离氨基氮含量(x±sd，n=6)

由表2可知,3株菌在发酵红豆乳中随着发酵时间的增加其游离氨基氮含量比对照组有明显的增长,其中菌株NM-6的蛋白质分解能力相对较强,培养48 h后其游离氨基氮含量达到1.215 mmol/L,比发酵前增加了83.8%,由显著性分析可得在发酵0 h和24 h时的游离氨基氮含量之间差异显著(p<0.05),而发酵24 h和48 h时其游离氨基氮含量之间差异不显著(p>0.05)。该菌在发酵24 h以内的游离氨基氮含量的增量明显高于24 h以后阶段,这说明菌株NM-6的蛋白质分解能力主要在发酵前期阶段呈现。从产酸和蛋白分解能力综合判断,选择菌株NM-6作为驯化菌株。

2.2 筛选菌株NM-6的驯化

2.2.1 菌株NM-6在红豆乳中的适应性 筛选菌株NM-6在LB培养基和红豆乳不同比例混合培养基中逐级并连续传代驯化结果见表3。

表3 菌株NM-6在不同比例培养基中pH和酸度的驯化值(x±sd，n=6)

注:同列肩标不同小写字母表示差异显著(p<0.05),相同字母为差异不显著(p>0.05),表4同。

从表3可以看出当混合培养基LB∶红豆乳=1∶1时,总酸度与比例8∶2的组别无显著性差异(p>0.05),且经反复实验结果分析得出在混合培养基(1∶1)中驯化效果较好且酸度较稳定,因此后方选择这个比例进行实验。

由表3和表4可知,菌株NM-6在驯化培养基中随着红豆乳比例的增大,其产酸能力总体呈现下降趋势,即豆乳比例越大,总酸度越小。将菌株NM-6在混合培养基中进行连续传代驯化后,其产酸能力随着传代次数的增加而增强。驯化第1代时的总酸度为0.25%,传代到第4代时的总酸度为0.42%,传代到第8代时的总酸度可达到0.55%,各组之间呈现出差异显著性(p<0.05),到第8代时其总酸度比传代前提高约2倍并且此时其酸度和pH均可达到稳定状态。这说明微生物自身具有高度适应环境的能力,当环境发生变化时,能够在其细胞内各种酶的协助下,迅速进行自我调节,使其形成适应于新环境的代谢系统[14]。

表4 菌株NM-6在混合培养基中的驯化适应性(x±sd，n=6)

2.2.2 菌株NM-6的驯化效果

2.2.2.1 菌株NM-6驯化前后产酸能力的变化 驯化前后的菌株NM-6在红豆乳中培养时的总酸度含量变化情况如图2所示。

图2 菌株NM-6驯化前后总酸度含量的变化Fig.2 The total acidity content of strain NM-6 through taming

由图2可知,在驯化后,菌株NM-6的产酸能力比驯化前均有所提高,在发酵24 h时的总酸度为0.31%,约是原来的1.4倍,在48 h时的总酸度达到0.43%,约是原来的约1.6倍,这说明菌株NM-6对红豆乳的适应性逐渐增强,产酸能力逐渐增大,呈现出良好的生长趋势。该菌株经驯化后可达到发酵酸豆奶所要求的酸度(0.3%～0.5%)[14]。

2.2.2.2 菌株NM-6驯化前后蛋白质分解能力的变化 驯化前后的菌株NM-6在红豆乳中培养时的游离氨基氮含量变化情况如图3所示。

图3 菌株NM-6驯化前后游离氨基氮含量的变化Fig.3 The free amino nitrogen content of strain NM-6 through taming

由图3可知,驯化后菌株NM-6在红豆乳培养过程中游离氨基氮的生成能力比驯化前均有所增加,在培养8 h时的游离氨基氮含量是1.084 mmol/L,比驯化前提高了25.6%,24 h和48 h时的含量分别为1.302 mmol/L和1.387 mmol/L,比驯化前分别提高了27.2%和25.3%。这说明菌株NM-6在红豆乳中的蛋白质分解能力在驯化后有所增强,所生成游离氨基酸或功能性短肽类物质的几率增大。

3 结论

实验结果显示,50株供试乳酸菌经无糖LB培养基中初筛以及在红豆乳中复筛后,获得了生长能力、产酸能力和蛋白质分解能力较好的菌株NM-6,其总酸度和游离氨基氮含量在37 ℃培养48 h时可分别达到了0.27%和1.215 mmol/L,且研究发现该菌的生长对数期出现在24 h段内,这样更加有利于缩短发酵时间,减少成本,有望可以作为无糖发酵红豆乳的生产菌株。

为了使菌株更好的适应红豆乳中的生长,使其在LB培养基和红豆乳不同比例的混合培养基中进行驯化。研究发现该乳酸菌在LB培养基和红豆乳混合培养基(1∶1)中逐级传代的产酸效果和稳定性是最好的,驯化后其总酸度和游离氨基氮含量分别达到了0.43%和1.387 mmol/L,比驯化前分别提高了59.3%和25.3%。在无糖条件下发酵制备的红豆乳其产酸能力和蛋白质分解能力均达到理想的效果,以期为今后红豆功能性食品的开发奠定实践基础。

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Screening and taming ofLacticacidbacteriain the fermented sugar-free red bean milk

WANG Li,DONG Ying-li,SHUANG Quan*

(College of Food Science and Engineering,Inner Mongolia Agricultural University,Hohhot 010018,China)

The growth ability of 50Lacticacidbacteriastrains isolated from the traditional fermented food in Inner Mongolia were screened in the sugar-free LB medium,and acid producing capability and protein decomposition capability were measured as the goal value in the red bean milk. Then the protein decomposition capability of selected strain was tamed gradually. The results showed that the three strains(S2-4,Sc8-1 and NM-6)were screened out with good growth ability,and one of the best strain NM-6 was selected by measuring protein decomposition capability in the red bean milk,and its total acidity and the free amino nitrogen content at 37 ℃ for 48 h were 0.27% and 1.215 mmol/L,respectively. After taming,the total acidity and the free amino nitrogen content of strain NM-6 were improved by 59.3% and 25.3%. The tamed strain had better adaptability in the red bean milk,at the same time the higher strain activity was helpful to improve the quality of soymilk yoghurt products.

Lacticacidbacteria;sugar-free medium;red bean milk;taming;screening

2015-03-23

王丽(1990-)，女，硕士，研究方向：食品工程，E-mail:15024908453@163.com。

*通讯作者:双全(1964-)，男，博士，教授，研究方向：食品科学,E-mail：shuangquan@imau.edu.cn。

国家自然科学基金(31460443)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)23-0186-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.23.030