肾损伤分子-1在肾小管上皮细胞缺氧损伤中的保护作用*

霍文谦，张克勤

(第三军医大坪医院野战外科研究所泌尿外科，重庆 400042)

肾损伤分子-1在肾小管上皮细胞缺氧损伤中的保护作用*

霍文谦，张克勤△

(第三军医大坪医院野战外科研究所泌尿外科，重庆 400042)

目的 观察肾损伤分子-1(KIM-1)对肾小管上皮细胞缺氧损伤时增殖及凋亡的影响，证实KIM-1对肾缺氧损伤的保护作用。方法 以人近端肾小管上皮细胞HK-2为研究对象，用pcDNA-hKIM-1质粒转染HK-2细胞，获得稳定表达KIM-1的pcDNA-hKIM-1-HK2细胞株。观察pcDNA-hKIM-1-HK2细胞(A组)和KIM-1抗体预处理pcDNA-hKIM-1-HK2细胞(C组)在缺氧损伤后细胞活力、凋亡指标及凋亡相关信号分子表达，以未转染缺氧HK-2细胞(B组)作为对照。结果 A组细胞活力指数高于B组(0.427±0.046vs.0.210±0.036，P<0.05)，细胞凋亡数量及流式细胞仪检测的缺氧早、晚期凋亡指数明显低于B组(P<0.05)。A组细胞缺氧时磷酸化ERK、磷酸化Akt表达较C组明显升高(P<0.05)。结论 KIM-1对肾小管上皮细胞缺氧损伤具有保护作用，其机制与激活PI3K-Akt/PKB和ERK信号通路抑制凋亡有关。

肾损伤分子1；肾小管上皮细胞；缺氧损伤；保护效应

肾损伤分子-1(kidney injury molecule-1,KIM-1)的发现为诊断肾缺氧损伤提供了理想的特异性预警分子，也带来了新的治疗靶点。新近研究发现KIM-1不仅是一种诊断肾损伤的特异性标志物，还可能作为一种保护性分子参与了肾损伤修复过程，因为KIM-1与某些增殖标志物共表达，另外KIM-1可能通过吞噬凋亡小体减轻肾小管梗阻[1]。但迄今关于KIM-1在肾小管上皮细胞缺氧损伤中的保护作用尚无直接证据。本研究通过建立pcDNA-hKIM-1-HK2细胞株，观察KIM-1在HK-2细胞缺氧损伤中的效应，从而提供KIM-1对肾小管缺氧损伤保护作用的直接证据。

1 材料与方法

1.1 材料 人近端肾小管上皮细胞HK-2(上海复祥生物科技有限公司)，pcDNA-hKIM-1质粒(哈弗医学院Ichimura教授馈赠)，人KIM-1 ELISA Kit 96T(上海沪尚生物科技有限公司)，鼠抗人KIM-1单克隆抗体(Sigma公司)，Hoechst染色试剂盒(上海BestBio)，质粒转染试剂盒Lipofectamine 2000(Lnvitrogen公司)，流式细胞仪(Coulter公司)。

1.2 方法

1.2.1 pcDNA-hKIM-1-HK2细胞株的建立 将质粒转化到DH5α感受态细胞，用质粒抽提试剂盒获得超纯质粒。HK-2细胞在5% CO2、37 ℃下培养24 h，加入质粒脂质体转染72 h。细胞消化后按1∶4密度传代到6孔板，每孔加G418 (400 μg/mL)，每3 天更换培养液1次，收集阳性细胞克隆扩大培养后继续G418筛选，获得稳定表达细胞株(pcDNA-hKIM-1-HK2)。

1.2.2 分组及缺氧培养 实验分3组，pcDNA-hKIM-1-HK2细胞缺氧损伤组(A组)、HK2细胞缺氧损伤组(B组，对照)、KIM-1抗体处理的pcDNA-hKIM-1-HK2细胞缺氧培养组(C组)。3组细胞用胰酶消化后将细胞密度调整为1×105/mL，分别加100 μL到96孔板中，放入1%氧浓度培养箱中缺氧培养24 h。其中C组细胞每孔加鼠抗人KIM-1单克隆抗体(100 μg/mL)1 μL。

1.2.3 ELISA法测定3组细胞KIM-1表达 取上述A、B、C组细胞，调整细胞浓度为5×106/mL。取上清离心5 min，-70 ℃冷藏待测。用KIM-1 ELISA Kit 96T试剂盒按说明操作测定3组细胞培养基中可溶性KIM-1表达。标准物的浓度与吸光度值计算出标准线的直线回归方程式，将样品的吸光度值代入方程式，计算出样品浓度(ng/L)，实验结果取3次平均值。

1.2.4 MTT法检测细胞活力 取3组缺氧细胞，加入20 μL MTT溶液继续缺氧培养4 h，小心吸去孔内培养液，每孔加入150 μL二甲基亚砜低速振荡10 min。使用酶标仪(490 nm)测定细胞活力。数据以检测的细胞活性指数表示，实验结果取3次平均值。

1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡 取3组缺氧细胞用稀释的Binding Buffer重悬细胞，细胞浓度调整到 15×106/mL，加入5 μL Annexin V-FITC，混匀后室温孵育15 min，加入5 μL(0.25 μg)的7-AAD染色液，避光室温孵育15 min。流式细胞仪激发波长633 nm，最大发射波长660 nm。凋亡数据以凋亡率表示，实验结果取3次平均值。

1.2.6 Western blot检测凋亡相关信号分子 取3组缺氧细胞全蛋白上清液15 μL用于十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，一抗(分别为兔抗人ERK1/2抗体、磷酸化ERK1/2抗体、磷酸化p38 抗体、磷酸化JNK抗体、Akt抗体、磷酸化AKT抗体、兔抗人β-actin抗体)孵育90 min，二抗(HRP标记的山羊抗兔IgG)孵育60 min，加入DAB 显色液，37 ℃避光显色。用Olympus AX70 图像分析系统进行积分光密度值分析，观察A组和C组与B组相比的相对积分光密度值变化。实验结果取3次平均值。

2 结 果

2.1ELISA法检测细胞KIM-1表达结果 3组细胞缺氧损伤后培养基中可溶性KIM-1表达检测结果见图1。A组细胞KIM-1浓度[(130.88±23.92)ng/L]与B组细胞[(19.78±4.60)ng/L]比较差异有统计学意义(t=13.681，P=0.002)，而C组细胞KIM-1浓度[(17.20±3.74)ng/L]与B组比较差异无统计学意义(t=0.407，P=0.753)。

a:P<0.05，与B组比较。

图1HK2细胞缺氧损伤后的可溶性KIM-1浓度检测

2.2MTT法检测细胞活力结果 3组细胞缺氧损伤后细胞活力检测结果见图2。A组细胞活性指数(0.427±0.046)与B组(0.210±0.036)比较差异有统计学意义(t=9.423，P=0.011)，而C组细胞活性指数(0.198±0.015)与B组比较差异无统计学意义(t=0.413，P=0.720)。

a:P<0.05，与B组比较。

图2HK2细胞缺氧损伤后的细胞活力检测(MTT法)

2.4 流式细胞仪细胞凋亡检测 3组细胞缺氧后流式细胞仪凋亡检测结果见图3。结果显示：A组细胞缺氧损伤后的早期凋亡量、晚期凋亡量及凋亡总量分别为(2.84±0.25)%、(5.29±1.27)%及(8.13±1.44)%，明显低于B组HK2细胞(t=20.280，7.958，25.301；P=0.002，0.015，0.002)。而C组细胞凋亡量[(18.55±6.381)%、(26.84±6.651)%、(45.39±6.377%)]与B组细胞相似(t=3.851，2.807，4.725；P=0.061，0.107，0.052)。

A：参照；B：A组；C：C组；D：B组。

图3HK2细胞缺氧损伤后的凋亡检测(流式细胞术)

2.5 凋亡相关信号分子表达 3组细胞缺氧损伤后的凋亡相关信号分子检测结果见图4。3组细胞ERK、Akt及磷酸化p38，磷酸化JNK的表达量无明显变化，而磷酸化ERK、磷酸化Akt表达在A组显著高于B组(5.33±1.02，4.39±1.31)，且明显高于C组(2.10±0.86，1.88±0.47)，t=12.146，17.372，P=0.012，0.015，提示KIM-1可能是通过PI3K-AKt/PKB通路和ERK通路来抑制细胞凋亡。

图4 HK2缺氧损伤的凋亡相关信号分子检测结果

3 讨 论

KIM-1是最新发现的一种跨膜蛋白，特异性表达于损伤后的近端小管上皮细胞，因此KIM-1一直被认为是诊断急性肾损伤的特异性标志物[1-2]。研究发现KIM-1是一种新的免疫球蛋白超家族上皮黏附分子，可能作为功能分子参与了细胞迁移、增殖和去分化[3-4]。Ichimura等[1]证实KIM-1是一种非骨髓来源的磷脂酰丝氨酸受体，使上皮细胞转化为吞噬细胞，借助吞噬受体吞噬小管凋亡细胞以促进修复。此外，可溶性KIM-1的Ig域可抑制整合素去极性化从而抑制细胞脱落并避免脱落细胞间及其与纤连蛋白间黏附，减少管型形成[1,5-6]。而且KIM-1主要表达于分裂期小管细胞并与Pax-2共表达，预示表达KIM-1的小管上皮细胞不是通过具有干细胞分化功能前体的选择性克隆扩增实现修复，而是与残存细胞的自我增殖有关[7-8]。

虽然KIM-1被确定参与了肾损伤及修复的过程，但机制尚未完全阐明。本研究发现KIM-1过表达可促进细胞增殖对抗缺氧损伤，与文献报道的KIM-1与细胞增殖标记物共阳性吻合。本研究结果不仅说明KIM-1是细胞增殖修复的标志，而且是作为一种功能分子直接参与了肾小管上皮缺氧损伤后的自我修复。Bailly等[9]发现肝细胞生长因子HGF(一种已知的肾上皮细胞修复因子)在吞噬凋亡细胞的小管上皮细胞中表达上调，推测KIM-1可能具有再生功能促进损伤细胞的替代或修复。因此，虽然具体机制不清，但本研究结果结合KIM-1在去分化的近端小管上皮细胞的特异性表达以及与细胞修复因子共表达，作者认为KIM-1可能通过调节肾小管上皮表型转化，促进上皮去分化以实现增殖修复功能。

诸多免疫球蛋白超家族上皮细胞黏附分子除了调节上皮细胞表型变化、迁移、增殖外，还具有抗凋亡作用[10]。比如T细胞免疫球蛋白域黏蛋白-1 (TIM-1)可促进T细胞增殖并保护T细胞免受Fas介导的凋亡，胰腺导管癌细胞L1样细胞黏附分子(L1CAM)可对抗化疗药物引起的细胞凋亡、ICAM-3抑制粒细胞凋亡，ICAM-1及VCAM-1抗血管内皮凋亡等[11-13]。另有研究发现：一种免疫球蛋白超家族上皮细胞黏附分子CD146可促进血管上皮细胞增殖，其在肾小管上皮的表达可对抗缺氧损伤凋亡，促进细胞的增殖和细胞间的同型黏附，在维持肾小管完整性和调节细胞渗透性等方面可能发挥着重要作用[14]。本研究发现，pcDNA-hKIM-1-HK2细胞在缺氧损伤后的凋亡量明显低于HK2细胞，这提示KIM-1作为新的免疫球蛋白超家族上皮黏附分子同样具有独立的抗缺氧凋亡作用，这种作用持续存在于损伤的早期及晚期。已知真核生物的细胞凋亡在后期主要是通过caspases途径来调节细胞凋亡，caspases家族通过调节凋亡信号和凋亡抑制信号间的相互作用最终实现促进或抑制细胞凋亡，抑制细胞凋亡的生存通路包括NFκB通路、PI3K-AKt/PKB通路、ERK通路[15]。本研究结果提示虽然还可能存在其他通路，但KIM-1激活PI3K-AKt/PKB通路和ERK通路抑制细胞凋亡途径参与了缺氧损伤保护机制。

综上所述，本研究证实了KIM-1在近端小管上皮缺氧损伤中的保护作用，结合文献本研究认为KIM-1可能通过影响近端小管上皮的表型变化，促进细胞增殖实现修复。同时，KIM-1具有独立对抗小管上皮细胞缺氧凋亡作用，这种功能可能与促进细胞的增殖和同型黏附，维持肾小管完整性和调节细胞渗透性有关。

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KIM-1 protects renal tubular epithelial cells from hypoxic injury*

HuoWenqian,ZhangKeqin△

(DepartmentofUrology,InstituteofSurgeryResearch,DapingHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity)

Objective To demonstrate the protective effect of Kidney injury molecule-1(KIM-1) on kidney hypoxic injury by observing the effect of KIM-1 on the proliferation and apoptosis of HK2 cells following hypoxic injury.Methods Human proximal kidney tubular epithelial cells (HK-2) were used in this study.The pcDNA-hKIM-1 plasmids were transfected into HK2 cells for obtaining pcDNA-hKIM-1-HK2 cell strain that stably expressed KIM-1.Cell viability,apoptosis and expression of apoptosis related signal molecules of pcDNA-hKIM-1-HK2(group A) and pcDNA-hKIM-1-HK2 pretreated by KIM-1 antibody(group C) were observed after hypoxic injury,and compared with the untransfected HK2(group B).Results The proliferation ability of group A was higher than the group B(0.427±0.046vs.0.210±0.036,P<0.05).The number of apoptotic cells and the apoptosis index determined by flow cytometry at early,middle and late hypoxic stages were obviously lower in the group A than in group B(P<0.05).The expression of phosphorylated ERK and phosphorylated Akt in group A increased significantly comparing with group C(P<0.05).Conclusion KIM-1 can protect renal tubular epithelial cells from hypoxic injury,and KIM-1 may suppress apoptosis through the activation of PI3K-AKt/PKB and ERK signal pathways.

kidney injury molecule-1;renal tubular epithelial cells;hypoxic injury;protective effect

第三军医大学青年人才创新基金资助(2010XQN30)。 作者简介：霍文谦(1976-)，主治医师，博士，主要从事肾缺血再灌注损伤研究。△

，Tel:13658361082；E-mail:zhkq2000@sina.com。

著·

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.17.002

R699.2

A

1671-8348(2015)17-2308-03

2014-10-18

2015-02-26)