骨髓内皮祖细胞移植对假孕大鼠黄体促血管生长因子表达的影响*

李广斌，孙艳明，宋春静，王 玲

(天津市胸科医院病理科 300222)

·论 著· doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2015.17.001

骨髓内皮祖细胞移植对假孕大鼠黄体促血管生长因子表达的影响*

李广斌，孙艳明，宋春静，王 玲△

(天津市胸科医院病理科 300222)

目的 观察骨髓内皮祖细胞(EPC)移植对假孕大鼠黄体促血管生长因子(VEGF)表达的影响，探讨骨髓EPC促进假孕大鼠黄体血管新生的作用机制。方法 雌性大鼠经137Cs全身照射后，尾静脉移植雄性大鼠骨髓EPC行造血重建，然后制备假孕模型为移植假孕组；分别于假孕第3、7、11、15 天应用real time PCR法检测黄体VEGF、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) mRNA的表达；蛋白免疫印迹法(Western blot)检测黄体VEGF、bFGF蛋白表达；CD31免疫组织化学法检测黄体微血管密度。结果 假孕对照组(输注等量培养液)及移植假孕组VEGF、bFGF表达在第7天达到最高；黄体微血管密度在第7、11天均高于第3天组水平(P<0.01)；移植假孕组VEGF、bFGF表达在第7、11天均高于同期假孕对照组(P<0.05)，且黄体微血管密度在第7、11天较同期假孕对照组高(P<0.05)。结论 骨髓EPC移植后黄体VEGF、bFGF mRNA及其蛋白表达水平升高，促进假孕大鼠黄体血管新生。

骨髓内皮祖细胞；黄体；新生血管化，病理性；务管内皮生长因子A；成纤维细胞生长因子2

内皮祖细胞(endothelial progenitor cell,EPC)是一类单个核细胞群，主要定居于骨髓，作为内皮细胞的前体细胞，在一定条件下，可以分化为成熟的内皮细胞，参与血管新生过程。卵巢黄体具有重要的内分泌调节功能，其微血管呈现周期性增生和闭锁及凋亡。在黄体期，其微血管呈现明显增生，由此带来的丰富血供是维持黄体微环境稳定，执行功能的重要保障，黄体功能不足或下降，往往与其血供减少有关。本课题组前期研究结果表明，由于骨髓EPC在假孕大鼠黄体向血管内皮细胞分化，促进了黄体血管新生，改善了黄体血供；本次实验主要目的在于探讨EPC移植后对假孕大鼠黄体血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)表达的影响，探讨其促进黄体血管新生的其他可能途径。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 清洁级Wistar雄性大鼠为供体鼠60只，体质量200～220 g。清洁级Wistar雌性大鼠为受体鼠120只，体质量180～200 g，由天津实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK(津)2010-0002。

1.1.2 主要试剂 孕马血清促性腺激素(PMSG)由宁波第二激素厂生产，批号：兽药字(2006)110254564。人绒毛膜促性腺激素(HCG)由上海生物化学制药厂生产，批号：0409013。RPMI1640培养液、胎牛血清(美国Gibco公司)；大鼠淋巴细胞分离液、CD31免疫组织化学染色试剂盒(天津灏洋生物制品科技有限责任公司)；VEGF、bFGF用逆转录PCR(RT-PCR)试剂盒(北京中山生物技术有限公司)；PCR引物(上海生物工程技术服务有限公司设计合成)；蛋白免疫印记法(Western blot)所用β-actin、VEGF、bFGF兔抗鼠多克隆抗体(美国 Santa公司)；BAC蛋白定量试剂盒(上海生物工程技术服务有限公司)。

1.1.3 主要仪器 Real time PCR Detection System(QIAGEN Instrument,AG)；DXY-2 稳压稳流电泳仪 (北京六一仪器厂)；凝胶成像系统(美国Kodak公司)；RM2135切片机(德国莱卡仪器有限公司)；Olympus DP71显微照相系统、BHT光学显微镜(日本Olympus公司)；Chemilmager TM5500凝胶成像系统(美国Alpha公司)。

1.2 方法

1.2.1 EPC的分离、移植 处死供体雄性大鼠，收集骨髓细胞悬液，分离采用大鼠淋巴细胞分离液(密度为1.077×103g/L)，2 000 r/min离心20 min，制备骨髓单个核细胞悬液，调整细胞浓度为(2～3)×107/mL，备用；受体雌性大鼠采用137Cs射线全身照射，照射前将大鼠卵巢部位用铅皮箍绑，照射剂量为7.50 Gy，剂量率为0.74 Gy/min。照射6 h后，受体大鼠经尾静脉注入供体鼠骨髓单个核细胞悬液1 mL(3×107个)。无菌条件下采取大鼠移植第7、15天眼内眦血，动态观察外周血象变化，以血象接近正常水平为造血重建成功。

1.3.2 假孕大鼠模型的制备、分组 受体大鼠于造血重建后，各组每只颈部皮下注射50 IU PMSG，48 h后每只皮下注射30 IU HCG，注射HCG 24 h后定义为假孕第1天。将受体大鼠随机分为3 d移植假孕组、7 d移植假孕组、11 d移植假孕组和15 d移植假孕组，每组15只；另取假孕大鼠40只尾静脉输注等量培养液作为假孕对照组，分为3 d假孕对照组、7 d假孕对照组、11 d假孕对照组和15 d假孕对照组，每组10只。

1.2.3 RT-PCR检测VEGF、bFGF的mRNA表达 取各组大鼠黄体组织样品，添加液氮研磨至粉末。蛋白酶K消化过夜后，酚-氯仿-异戊醇抽提基因组DNA。VEGF上游引物：5′-GCACGTTGGCTCACTTCCAG-3′,下游引物：5′-TGG TCG GAA CCA GAA TCT TTA TCT C-3′；bFGF上游引物：5′-TTC ACA GCC TGT GCT CTAG GG-3′,下游引物：5′-GAT CGG GT CAG GTT TTG GAA A-3′；β-actin：上游引物：5′-GGG AAA TCG TGC GTG ACA TT-3′，下游引物：5′-GCG GCA GTG GCC ATC TC-3′。以基因组DNA作为模版进行PCR扩增，并以β-actin作为参照。PCR反应：10 μL体系中加入基因组DNA样品1.0 μL，上、下游引物各0.1 μL。反应条件：95 ℃，5 min预变性；98 ℃ 10 s，57.5 ℃ 30 s，72 ℃ 10 s，30个循环；72 ℃ 10 min补平末端。VEGF的PCR产物为107 bp，bFGF的PCR产物为51 bp，β-actin的PCR产物为76 bp。PCR产物鉴定经1.5%的琼脂糖(含有0.5 mg/mL溴化乙锭)凝胶电泳后，将凝胶放入成像仪中，紫外光下自显影，扫描成像。利用Image J计算条带灰度值。

1.2.4 Western blot检测黄体组织中VEGF、bFGF蛋白表达 取各组大鼠黄体组织样品，按照BAC蛋白定量试剂盒说明提取大鼠黄体标本蛋白，进行蛋白定量测定。上样量80 μg，8%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，电转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上；封闭2 h后滴加一抗(一抗稀释浓度1∶100)，4 ℃孵育过夜；3次洗膜后二抗室温孵育30 min，ECL显影，洗片。以β-actin(1∶200稀释)作为内对照，胶片经扫描仪扫描后获得图像，用Bandleader软件进行灰度分析，计算目的蛋白条带与β-actin的灰度比值作为目的蛋白相对表达量。

1.2.5 免疫组织化学检测黄体组织中CD31的表达 CD31染色按照免疫组织化学试剂盒说明书进行。CD31兔抗鼠多克隆抗体(1∶50稀释)。结果判断：CD31免疫组织化学阳性产物为棕黄色颗粒，主要表达于血管内皮细胞的细胞膜和细胞质。通过CD31标记黄体血管，检测黄体微血管密度(MVD)。

1.2.6 MVD检测计算方法 低倍镜下(×100)扫查整个切片，寻找3个血管高密度区，再在高倍镜下(×400)计数这3个视野的被染成棕黄色的微血管数，对微血管的识别不需具备完整的管腔和红细胞，具有棕黄色的内皮细胞或内皮细胞簇且与邻近微血管和其他组织成分清楚分开，即为一个可计数的微血管，取此3个视野微血管数的平均值作为MVD值。

2 结 果

2.1 各组大鼠移植后生存情况 移植假孕各组大鼠在骨髓移植7d后一般状态开始下降，各组均有动物出现不同程度的毛色杂乱，食欲减退，体质量下降等，14d后一般状态好转，动物存活率约65%。

2.2 各组大鼠黄体组织VEGF、bFGFmRNA表达结果 假孕对照组大鼠黄体VEGFmRNA表达在第7天达到最高，显著高于3d假孕对照组水平(P<0.01)，第11天开始下降，表达仍高于3d假孕对照组(P<0.05)，第15天接近3d假孕对照组水平；bFGF表达也在第7天达到最高，高于3d假孕对照组水平(P<0.05)，之后开始下降，第15天接近3d假孕对照组水平，与3d假孕对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。移植假孕组VEGF表达在第7天达到最高，第11天开始下降，仍显著高于3d移植假孕组水平(P<0.01)，第15天接近3d移植假孕组水平，且在第7、11、15天表达均高于同期假孕对照组(P<0.05)；移植假孕组bFGF表达与VEGF呈现相似趋势，表现为第7天最高，之后下降，且在第7、11天表达高于同期假孕对照组(P<0.05)，见表1。

表1 各组大鼠黄体组织VEGF、bFGF的mRNA表达±s)

a：P<0.05，b：P<0.01，与3 d组比较；c：P<0.05，与同期假孕对照组比较。

表2 各组大鼠黄体组织VEGF、bFGF的蛋白表达±s)

a：P<0.05，b：P<0.01，与3d组比较；c：P<0.05，与同期假孕对照组比较。

1、2、3、4分别为第3、7、11、15天组。

图1 各组大鼠黄体组织VEGF、bFGF蛋白表达

2.3 各组大鼠黄体组织VEGF、bFGF蛋白的表达结果 假孕对照组黄体VEGF蛋白表达在第7天达到高峰，与3d假孕对照组比较有统计学差异(P<0.01)，之后持续下降；移植假孕组VEGF表达亦于第7天达到高峰，与3d假孕对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)，第11天下降，与3d移植假孕组比较差异仍有统计学意义(P<0.05)，到第15天表达最低；且在第7、11天组VEGF表达高于同期假孕对照组(P<0.05)。bFGF表达在假孕对照组及移植假孕组均在第7天最高，与3d组比较有统计学差异(P<0.05，P<0.01)，之后持续下降，到第15天表达最低；在第7天，移植假孕组bFGF表达较假孕对照组升高(P<0.05)，见表2，图1。

2.4 各组大鼠黄体微血管MVD检测结果 假孕对照组黄体微血管密度在第7天最高，随后下降，第7、11天与第3天组比较差异均有统计学意义(P<0.01)，第15天表达最低；移植假孕组黄体微血管密度变化趋势与假孕对照组相似，且第7、11天移植假孕组黄体微血管密度高于同期假孕对照组(P<0.05)，见表3、图2。

表3 CD31免疫组织化学检测各组大鼠黄体组织微血管MVD检测结果±s)

a:P<0.01，与3 d组比较；b：P<0.05，与同期假孕对照组比较。

1：3 d，2：7 d，3:11 d；4:15 d。

图2 移植假孕组大鼠黄体组织微血管CD31免疫组织化学染色 (×400)

3 讨 论

血管新生是指在机体生长发育过程中或创伤修复、缺血、缺氧和炎症等情况下,原有微血管内皮细胞经过出芽、迁移、增殖与基质重塑等最终形成新毛细血管的过程。目前研究发现，EPC经动员归巢到目的器官是促进组织血管新生的有效途径[1]。黄体作为发生生理性血管新生的少数几个成年组织之一，在黄体期，其微血管呈现明显增生，这个过程对于维持黄体功能至关重要[2]。作者之前的研究观察到，EPC归巢到黄体后，可以通过分化为内皮细胞促进黄体血管新生；本次实验观察到，在假孕对照组及移植假孕组大鼠黄体中，VEGF和bFGF的表达在总体上呈现类似的先升后降的趋势；同时，移植假孕组VEGF在mRNA及蛋白的表达上，在第7、11天高于同期假孕对照组(P<0.05)；bFGF的表达在第7天高于同期假孕对照组(P<0.05)；黄体微血管密度在第7、11天高于同期假孕对照组(P<0.05)。

VEGF是一种极强的血管增生促进剂，在绝大多数动物(如小鼠和人类)的黄体化颗粒细胞中都可以检测到VEGF mRNA[3],而且在颗粒细胞黄体化过程中,VEGF的表达量显著增加[4]。bFGF是一种作用广泛的细胞因子，主要分布于神经组织、垂体、肾上腺、卵巢和胎盘，诱导新生血管形成[5]。卵巢中的bFGF主要来源于黄体颗粒细胞，卵泡膜细胞等，bFGF通过自分泌和旁分泌形式调节血管新生，且与VEGF关系密切，在体外培养的内皮细胞中给予bFGF,可以发现VEGF的表达增加,如果阻断了VEGF的表达,bFGF就不能诱导内皮细胞形成血管[6]。另有报道，体外培养的骨髓单个核细胞具有分泌VEGF及bFGF、胰岛素样生长因子的能力[7]；骨髓单个核细胞能够释放VEGF和单核细胞趋化蛋白-1,并发现EPC在分化为血管内皮细胞的过程中能分泌bFGF[8]。本实验在建立大鼠假孕模型的基础上，进行同种异体EPC移植，通过观察黄体VEGF、bFGF mRNA及蛋白的表达，观察黄体微血管密度的变化，综合评价EPC移植对假孕大鼠黄体促血管生长因子表达的影响，发现移植EPCs促进黄体血管新生，其机制可能并不仅仅是本研究之前观察到的单纯自身分化作用，EPCs同时也以自分泌和旁分泌的形式影响着局部血管生成因子的释放，促进了黄体VEGF及bFGF的表达，从而促进了黄体血管的新生，进一步探讨了EPCs移植促进黄体血管新生的可能机制，为EPCs移植缓解黄体血管新生不足导致的黄体功能下降和不全提供理论和实验依据。

[1]Asahara T,Mufobara T,Sullivan A,et al.Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis[J].Science,1997,275(32):964-967.

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Effection of bone marrow endothelial progenitor cell transplantation on the expression of corpus luteum angiogenic growth factors*

LiGuangbin，SunYanming，SongChunjing，WangLing△

(DepartmentofPathology,TianjinChestHospital,Tianjin300222,China)

Objective To observe the effection of bone marrow endothelial progen-itor cells(EPCs) transplantation on corpus luteum angiogenic growth factors expression,and investigate the mechanism of the EPCs to promote the angiogenesis of pseudopregnancy rat corpus luteum.Methods Female rats radiated by137Cs were transplanted EPCs which came from male rat via tail vein.The pseudocyesis model of transplantated female rat was established after hematopoietic reconstitution,which named as pseudopregnancy group.On 3rd,7th,11th and 15th day,Vascular endothelial growth factor(VEGF) and basic fibroblast growth factor(bFGF) mRNA were tested through the method of RT-PCR,their protein expression were tested through the method of Western blotting,and the the corpus luteum capillary density were tested through CD31 immunohisto chemistry.Results In pseudopregnancy control groups and transplantation pseudopr-egnancy groups,the VEGF、bFGF expression achieved the peak on 7th day.The corp-us luteum capillary density was higher than that of 3rd day group(P<0.01)on the 7th and 11th day group.The expression of VEGF and bFGF of transplantation pseudopregnancy group were higher than that of pseudopregnancy control group on 7th,11th day(P<0.05),the corpus luteum capillary density of transplantation pseudopregnancy group were higher than that of pseudopregnancy control group on 7th and 11th day(P<0.05).Conclusion EPCs transplantation can increase the expression of VEGF and bFGF mRNA,and promote the growth of corpus luteum angiogenesis.

bone marrow endothelial progenitor cell；corpus luteum;angiogenesis,pathologil;vascular endothelial growth factor A；fibroblast growth factor 2

国家自然科学基金项目资助(30873281)。 作者简介：李广斌(1975-)，主治医师，硕士，主要从事病理学研究。△

，Tel:(022)27386453；E-mail:minniezjj@sina.com。

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