响应面法优化核桃降压肽的酶解工艺研究

卢 娣,吴庆智,毛晓英,*,陈国刚,邵 理

(1.石河子大学食品学院,新疆石河子 832000;2.石河子开发区神内食品有限公司,新疆石河子 832000)

响应面法优化核桃降压肽的酶解工艺研究

卢 娣1,吴庆智2,毛晓英1,*,陈国刚1,邵 理1

(1.石河子大学食品学院,新疆石河子 832000;2.石河子开发区神内食品有限公司,新疆石河子 832000)

本研究以低温脱脂核桃粕为原料,采用碱溶酸沉提蛋白后,分别用碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和风味蛋白酶制备核桃多肽,以血管紧张素转化酶(Angiotensin-I-Converting Enzyme,ACE)抑制率和水解度为指标,选出酶解效果最好的酶,并且对其底物质量浓度、加酶量、酶解温度、酶解时间和pH进行单因素实验,在此基础上采用响应面实验优化其制备核桃降压肽的最佳水解工艺。结果表明:在底物质量浓度30g/L、加酶量8000U/g、酶解温度57℃和pH8.6的条件下水解3h,ACE抑制率可达64.32%,此时酶解液的水解度为21.57%。

核桃粕,碱性蛋白酶,ACE抑制肽,酶解,响应面分析

高血压是一种常见的心脑血管疾病,会引起心血管、大脑、肾脏的病变[1]。降压肽是一种ACE抑制剂,通常用于高血压患者的治疗[2]。目前,对高血压患者的治疗通常使用化学合成的药物,然而,这些合成药物有一些副作用,包括咳嗽和皮疹[3]。食源性降压肽来源于天然植物,无副作用,易被人体吸收[4]。不同的植物来源,降压功效作用也是不同的。

目前,研究者已经从不同的食物中利用发酵、酶解等方法提取了不同序列的降压肽,如:玉米、大豆、花生、米糠、杏仁等,在一定程度上起到了降血压的作用[5-7]。但是对以核桃粕为原料提取降压肽的研究较少。实验以核桃粕为原料,制备降压肽,在一定程度上拓展了食源性降压肽原料的来源,其降压活性也很显著。核桃粕是核桃经过提取油后的副产物,含有29.65%蛋白质,提油后的核桃粕多数被用作饲料,资源造成了一定的浪费,酶解核桃粕蛋白制备降压肽可以促进核桃粕的深加工,实现资源的综合利用。研究采用酶法水解蛋白质,其条件温和,对多肽活性的影响较小,过程容易控制[8-9]。本实验以脱脂核桃粕为原料,以水解度和ACE抑制率为指标,首先通过比较四种商业化蛋白酶对核桃蛋白的酶解效果确定最佳用酶,然后用响应面法对其工艺进行优化。本研究为核桃粕的综合利用和核桃的深加工提供了一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

核桃粕 康福寿核桃油加工有限公司;2709碱性蛋白酶(Alcalase)和中性蛋白酶 均购于北京博奥拓达科技有限公司;木瓜蛋白酶和风味蛋白酶 均购于sigma公司;FAPGG(呋喃丙烯酰三肽) 购于sigma公司;ACE(血管紧张素转换酶) 购于sigma公司;正己烷、盐酸、浓硫酸、氢氧化钠等均为分析纯。实验用水均为去离子水。

快速恒温数显水浴锅 金坛市医疗仪器厂;PHS-3 C雷磁pH计 上海精科仪器;BS 2000 S电子天平 北京赛多利斯科学仪器有限公司;FDU-1200冷冻干燥机 北京四环科学仪器厂;ELx 808酶标仪 Thermo公司;SH 21-1磁力搅拌器 上海梅颖浦仪表制造有限公司;DNP-9272电热恒温培养箱 上海精宏实验设备有限公司。

1.2 技术路线

低温脱脂核桃粕→过60目筛→脱脂→提取核桃蛋白→酶解用酶的优化→碱性蛋白酶酶解条件的优化→核桃ACE抑制肽酶解液

1.3 核桃脱脂粉的制备

核桃粕经粉碎后过60目筛,用正己烷以1∶5(g/mL)的料液比在磁力搅拌器上提取1h后进行抽滤,取滤渣重复用正己烷提取至滤液无色透明时收集滤渣,然后用恒温干燥箱烘干溶剂,置于冰箱4℃冷藏备用。

1.4 核桃蛋白的提取

采用碱溶酸沉法提取核桃蛋白。参照毛晓英[10]的方法,略改。以核桃脱脂粉为原料,通过95%醇洗(1∶10,g/mL),过滤,把滤饼置恒温干燥箱烘干溶剂。然后用去离子水配制蛋白质溶液(1∶26,w/v),用2.0mol/L氢氧化钠溶液调节蛋白液的pH到11.0,置磁力搅拌器上53℃搅拌1.5h后7000r/min 25℃离心15min,取上清液,用2.0mol/L盐酸溶液调节pH至4.5,搅拌1h,7000r/min 25℃离心15min,水洗沉淀,调节pH至中性后用冷冻干燥机冻干,置于冰箱4℃冷藏备用。

1.5 酶解工艺

称取一定量核桃蛋白,加去离子水配制成一定浓度的水解底物于水浴锅中90℃10min处理后,调至最适的pH,加入一定量蛋白酶,调至最适温度于水浴锅中水解一段时间后于90℃10min灭酶终止反应,8000r/min离心15min取上清液,测定ACE抑制率和水解度。

1.6 蛋白酶的筛选

分别将碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和风味蛋白酶8000U/g加入浓度20g/L的蛋白质溶液中,按照1.5酶解工艺于每种酶最适的pH和温度下水解4h,测定ACE抑制率和水解度。

表1 四种商业酶最适作用条件和酶活力Table 1 The optimum hydrolysis conditions and the enzymatic activity of four commercial enzymes

1.7 核桃降压肽制备的单因素实验和响应面实验设计

以核桃降压肽的ACE抑制率和水解度为指标分别考察温度(℃)、底物质量浓度(g/L)、加酶量(U/g)、酶解时间(h)和pH五个因素对核桃降压肽制备的影响,进行单因素实验。

在单因素研究的基础上,选取最优的温度(℃)、底物质量浓度(g/L)、加酶量(U/g)和pH四个因素为响应变量,以ACE抑制率为响应值,设计响应面分析实验。因素水平及编码表见表2。

表2 因素水平及编码表Table 2 The table of factors and level

1.8 检测指标

1.8.1 水解度的测定 采用pH-Stat法[11]。

1.8.2 ACE抑制率的测定 在96孔酶标板上按表3设计添加反应物开始反应,在340nm波长条件下,用酶标仪测吸光值A1。使其在37℃的恒温培养条件下反应30min,测量吸光度A2,作3组平行实验[12]。

ACE抑制率的计算公式如下:

ΔA=A1-A2

式中:ΔAb为加入缓冲基质时吸光度在30min内的变化;ΔAa为加入抑制剂时吸光度在30min内的变化。

表3 ACE抑制活性的测定Table 3 The determination of ACE inhibition activity

注:1.FAPGG(1.0mmol/L):取3.994mg FAPGG加基质缓冲液2,定容至10mL,溶解混合,置4℃避光放置;2.基质缓冲液1:pH8.3、100mmol/L的硼酸缓冲液;3.基质缓冲液2:pH8.3、100mmol/L的硼酸缓冲液(含300mmol/L NaCl)。

2 结果与讨论

2.1 水解蛋白酶的筛选

将上述的四种蛋白酶在各自的最适酶解条件下对核桃蛋白进行酶解,以ACE抑制率和水解度为指标,选出制备核桃降压肽的最适用酶,结果见图1。

图1 四种酶解液的ACE抑制率及其水解度的比较Fig.1 Comparison the four kind of enzyme solution on ACE inhibition rate and hydrolysis degree

由图1可以得到,不同蛋白酶对核桃粕蛋白的水解能力存在明显差异,这与蛋白酶的底物特异性有关[13]。其中水解液的ACE抑制率和水解度相对较高的是碱性蛋白酶。ACE抑制肽构效关系研究表明,强ACE抑制活性肽的C-端氨基酸倾向于疏水性氨基酸。碱性蛋白酶的酶切位点在疏水氨基酸的C-端,当C-端为疏水性氨基酸时,小肽具有较强的ACE活性[14]。研究报道表明,核桃脱脂粉和核桃蛋白分离组分的氨基酸组成中,以谷氨酸、精氨酸、天冬氨酸含量较高,且主要以酸性氨基酸和疏水性氨基酸为主[10]。风味蛋白酶的作用范围较广,但是其对核桃蛋白的水解力相对较弱,中性蛋白酶主要作用于芳香族氨基酸的羧基参与形成的肽键,木瓜蛋白酶属巯基蛋白酶,具有较宽的底物特异性。研究结果表明,碱性蛋白酶对核桃蛋白的水解能力明显高于风味蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜白酶,说明核桃蛋白的结构中存在较多的碱性蛋白酶的作用位点,从而更有利于ACE抑制肽的释放。此外,这与宋亮等人[5]以玉米为原料和孔令明等人[7]以杏仁为原料酶法制备ACE抑制肽报道的结果比较相似。综合考虑选择碱性蛋白酶为最适酶。

2.2 碱性蛋白酶的酶解工艺

2.2.1 单因素实验

2.2.1.1 pH对水解度和酶解液ACE抑制率的影响 由图2可以看出,pH对碱性蛋白酶水解核桃蛋白有显著影响。在pH为8.5时酶解液ACE抑制率和水解度达到最大值,随着pH的继续增大,ACE抑制率和水解度都相对有所减小。这说明较高pH可能导致碱性蛋白酶的失活,不利于水解。选择最佳酶解pH为8.5。

图2 pH对酶解液ACE抑制率和水解度影响Fig.2 The influence of enzyme solution ACE inhibition rate and hydrolysis degree by pH

2.2.1.2 底物质量浓度对水解度和酶解液ACE抑制率的影响 由图3可知,随着底物质量浓度的增大,ACE抑制率和水解度先增大后减小,由于酶解初期随着底物质量浓度增大多肽含量增加,故ACE抑制率和水解度增大,在底物质量浓度为30g/L时达到最大值,继续增大底物质量浓度,ACE抑制率和水解度都相对有所减小,原因可能是随着底物质量浓度的增大,酶解液的有效水分含量过低,减少了在反应过程中底物和蛋白酶间碰撞的机会,对水解产生抑制的作用[15]。选择最适底物质量浓度为30g/L。

图3 底物质量浓度对酶解液ACE抑制率和水解度影响Fig.3 The influence of enzyme solution ACE inhibition rate and hydrolysis degree by substrate concentration

2.2.1.3 酶解温度对水解度和酶解液ACE抑制率的影响 由图4可知,随着温度的增加,酶解液的ACE抑制率和水解度均呈现增大的趋势,当酶解温度为55℃时达到最大值,持续升高温度反而会减小,这可能是因为在一定的范围内随着温度的增加,有利于酶解反应的进行。当温度过高时,导致酶蛋白变性,使酶活减弱。选择最适温度为55℃。

图4 酶解温度对酶解液ACE抑制率和水解度影响Fig.4 The influence of enzyme solution ACE inhibition rate and hydrolysis degree by temperature

2.2.1.4 加酶量对水解度和酶解液ACE抑制率的影响 由图5可知,随着加酶量的增大,酶解液的ACE抑制率和水解度增大,在加酶量为7000U/g时ACE抑制率达到最大值,原因可能是随着酶浓度的增加,有利于酶与底物的结合,对酶解有促进的作用。随着加酶量的继续增大,酶解液的ACE抑制率和水解度略有降低,原因可能是一部分具有ACE抑制活性的多肽被进一步水解成不具有降压活性的小肽。故选择7000U/g为最适加酶量。

图5 加酶量对酶解液ACE抑制率和水解度影响Fig.5 The influence of enzyme solution ACE inhibition rate and hydrolysis degree by enzyme dosage

2.2.1.5 酶解时间对水解度和酶解液ACE抑制率的影响 由图6可知,当酶解时间从1.5h开始,随着酶解时间的延长水解度和ACE抑制率呈逐渐增大趋势,3h后酶解液的水解度上升缓慢,这可能是因为在反应的初始阶段,蛋白酶和底物均处于较高的浓度水平,酶解反应速率较大,随着反应的进行,碱性蛋白酶的浓度逐渐降低,酶解产物浓度增加,其竞争抑制性增强,酶的活性随着反应的进行而降低,导致在3h以后增加酶解时间,ACE抑制率和水解度增加缓慢。故选择酶解时间为3h。

图6 酶解时间对酶解液ACE抑制率和水解度影响Fig.6 The influence of enzyme solution ACE inhibition rate and hydrolysis degree by time

2.2.2 各因素之间的交互作用 实验发现在影响酶解过程的主要因素温度(℃)、底物质量浓度(g/L)、加酶量(U/g)、酶解时间(h)和pH中,过高或过低的温度(℃)、底物质量浓度(g/L)、加酶量(U/g)和pH对酶解液的ACE抑制率有显著影响。从酶解时间对酶解液ACE抑制率的影响的曲线中可以看出,当酶解时间超过3h时,酶解液的ACE抑制率和水解度增加缓慢,因此确定酶解时间为3h,避免过长时间造成的能源消耗。故在单因素实验的基础上,以温度(℃)、底物质量浓度(g/L)、加酶量(U/g)和pH为响应变量,以ACE抑制率(%)为响应值,采用四因素三水平对核桃蛋白酶解物进行响应面分析实验,结果见表4。

表4 响应面实验设计及结果Table 4 The design and results of the response surface experimental

对表4进行回归分析,以ACE抑制率(%)为响应值建立的二次响应面回归方程如下:

Y=62.33600+8.62583A+2.99583B+2.77083C+2.22750D-1.99750AB-1.21750AC-3.20250AD-0.37500BC+1.41000BD-3.21500CD-8.84300A2-5.84550B2-4.53550C2+0.38450D2

对回归方程进行方差分析,结果见表5。

表5 回归模型及方差分析结果Table 5 Decolorization regression model and analysis of variance

2.2.3 最佳条件的响应面优化 由图7、图8和图9直观地反映了各因素的交互作用。可以看出,随着底物质量浓度的增大,ACE抑制率先增加后降低,说明在实验实验范围内存在酶水解的最佳底物质量浓度,当低于或高于该底物质量浓度时,都会影响ACE的抑制率。同样,对于加酶量、酶解温度和pH都存在适合碱性蛋白酶水解的最佳值。因此,在实验所选择的因素水平范围中存在最优的酶解条件组合使得核桃降压肽的ACE抑制率达到最大。

图7 底物质量浓度和加酶量交互作用响应曲面Fig.7 The response surface of the influence of ACE inhibition rate by substrate concentration and enzyme dosage

图8 加酶量和酶解温度交互作用响应曲面Fig.8 The response surface of the influence of ACE inhibition rate by enzyme dosage and temperature

图9 加酶量和酶解温度交互作用响应曲面Fig.9 The response surface of the influence of ACE inhibition rate by enzyme dosage and pH value

2.2.4 验证实验 利用Design-Expert 8.0软件进行工艺参数的优化组合,得到碱性蛋白酶酶解核桃蛋白制备ACE抑制肽的最佳工艺为:底物质量浓度28.99g/L、加酶量8000U/g、pH8.64,酶解温度56.67℃,ACE抑制率可达到66.45%。根据实验室条件调整酶解工艺为底物质量浓度30g/L、加酶量8000U/g、pH8.6,酶解温度57℃,得到的实际抑制率64.32%,相对误差2.13%,此时酶解液的水解度为21.57%。

由此可看出实际测出值与理论值相差不大,说明响应面优化对碱性蛋白酶水解核桃蛋白制备ACE抑制肽的工艺参数是可行的。研究人员采用不同核桃品种通过酶解制备降压肽进行了研究,朱振宝[16]等用Alcalase 2.4L酶解核桃分离蛋白,在酶解工艺条件为pH7.94,酶解温度60℃,底物质量浓度30g/L,酶与底物质量比3.69∶100,酶解3h得到抑制率为76.58%的ACE抑制肽,包怡红等[17]用碱性蛋白酶酶解山核桃蛋白在酶解工艺条件为pH8.2,酶解温度56℃,加酶量5800U/g,酶解4h得到抑制率为72.48%的ACE抑制肽,对比研究工艺条件和研究结果表明,本研究中所用方法得到的ACE抑制肽的抑制率接近同领域研究者研究的鲜核桃制备ACE抑制肽的抑制率。

3 结论

本研究分别用碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和风味蛋白酶酶解核桃蛋白制备核桃降压肽,以ACE抑制率和水解度为指标,对比结果筛选碱性蛋白酶为最适酶。

在单因素实验的基础上进行响应面实验,以ACE抑制率为指标,确定了碱性蛋白酶水解工艺的最佳参数为底物质量浓度30g/L、酶添加量8000U/g、pH8.6、酶解温度57℃,得到的酶解液的水解度为21.57%,实际抑制率可达到64.32%。本研究得到了较高的ACE抑制率结果为核桃粕的深加工提供了一定的指导方向,从而为进一步拓宽核桃产业提供思路和理论指导奠定了基础。

[1]孙广辉. 高血压研究新进展[J]. 镇江医学院学报,2000,10(3):597-599.

[2]陈元荣. 血管紧张素转化酶抑制剂的临床应用[J]. 实用医技杂志,2005,12(1A):127-128.

[3]Abraham T Girgih,Chibuike C Udenigwe,Huan Li,et al. Kinetics of Enzyme Hydrolysis and Antihypertensive Effects of Hemp seed(CannbissativaL.)Protein Hydrolysis[J]. Journal of the America Oil Chemists Society,2011,88(11):1767-1774.

[4]Yu ZP,Liu BQ,Zhao WZ,et al. Primary and structure of novel ACE-inhibitory pepides from egg white protein[J]. Food Chemistry,2012,133(2):315-322.

[5]宋亮,曹龙奎,刁静静,等. 玉米ACE抑制肽水解酶的筛选及酶解条件的优化[J]. 食品工业科技,2012,33(16):204-208.

[6]于婷婷,韩飞,陈光. 大豆降压肽研究进展[J]. 粮油食品科技,2008,16(2):27-29.

[7]孔令明,劳斐,李芳,等. 响应面法优化杏仁ACE抑制肽的酶解工艺研究[J]. 中国食品添加剂,2013(1):130-136.

[8]Wenjuan Qu,Haile Ma,Zhongli Pan,et al. Preparation and antihypertensive antivity of peptides from Porphyra yezoensis[J]. Food Chemistry,2010,123(1):14-20.

[9]Maria Rubi Segura-Campos,Luis Antonio Chel-Guerrero,David Abram Betancur-Ancona. Purification of angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides from a cowpea(Vigna unguiculata)enzymatichy drolysate[J]. Process Biochemistry,2011,46(4):864-872.

[10]毛晓英. 核桃蛋白质的结构表征及其制品的改性研究[D]. 无锡:江南大学,2012.

[11]Adler-Nissen Jens. Enzymatic Hydrolysis of Food Protein[M]. Essex:Elsevier Applied Science Publishers LTD,1986:122-144.

[12]刘志国,吴琼,吕玲肖,等. 酶解米糠蛋白分离提取ACE抑制肽及其结构研究[J]. 食品科学,2007,28(3):223-228.

[13]张丰香,李清华,王霞,等. 鱼鳞血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽的制备工艺研究[J]. 食品工业科技,2013,34(24):199-204,224.

[14]Saito Y,Wanezaki K,Kawato A,et al. Structure and activity of angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides from sake lees[J]. Bioscience Biotechnology Biochemistry,1994,58(10):1767-1771.

[15]P Gonzalez-Teilo,F Camacho,E Jurado,et al. Enzymatic hydrolysis of whey protein:I kinetic modeis[J]. Biotechnology and bioengineering,1994,44(4):523-528.

[16]朱振宝,周慧江,易建华. Alcalase 2.4L酶解核桃分离蛋白制备ACE抑制肽的工艺研究[J]. 中国油脂,2013,38(2):40-44.

[17]包怡红,于阳阳,赵若诗. 酶解山核桃蛋白制备降血压肽的工艺[J]. 食品科学,2013,34(1):220-224.

Optimization of enzymatic hydrolysis of ACE in inhibition peptides from walnut protein by response surface method

LU Di1,WU Qing-zhi2,MAO Xiao-ying1,*,CHEN Guo-gang1,SHAO Li1

(1. Food College,Shihezi University,Shihezi 832000,China；2. Shennei Food Limited Company,Shihezi Development Zoon,Shihezi 832000,China)

In this paper,walnut protein,extracted form defatted walnut meal and then was separated by alkaline extraction-isoelectric precipitation technique,was hydrolyzed by four protease(alkaline protease,neutral protease,papain and flavor protease)for production of antihypertensive peptides. As an index,ACE inhibitory rate and the degree of hydrolysis were determined to select the proper enzyme with best enzymatic effect. Then single factor experiments were carried out to research the effects of the factors such as substrate concentration(g/L),enzyme dosage(U/g),hydrolysis time(h),hydrolysis temperature(℃)and pH. The response surface methodology was used to optimize conditions of the enzymatic hydrolysis. The results showed that the optimum conditions were substrate concentration 30g/L,enzyme dosage 8000U/g,temperature 57℃,pH8.6 and time of enzymatic hydrolysis 3h. The ACE inhibition rate could reach 64.32% and the degree of hydrolysis was 21.57%.

walnut meal;alkaline protease;ACE inhibition peptide;enzymatic hydrolysis;response surface methodology

2014-10-08

卢娣(1990-)，女，在读硕士，研究方向：果蔬加工及贮藏。

*通讯作者:毛晓英(1976-),女，博士，研究方向：农产品加工与贮藏。

石河子大学优秀青年项目(2013ZRKXYQ14)。

TS229

B

1002-0306(2015)11-0233-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.11.039