豉香型白酒酒饼中高产乙酸乙酯酵母菌的分离鉴定及发酵性能研究

黄光建,徐学锋,+,郭梅君,曹 劲,杨幼慧,*

(1.华南农业大学食品学院,广东广州 510642;2.广东省九江酒厂有限公司,广东佛山 528203)

豉香型白酒酒饼中高产乙酸乙酯酵母菌的分离鉴定及发酵性能研究

黄光建1,徐学锋1,+,郭梅君2,曹 劲1,杨幼慧1,*

(1.华南农业大学食品学院,广东广州 510642;2.广东省九江酒厂有限公司,广东佛山 528203)

从豉香型白酒酒饼中分离获得高产乙酸乙酯酵母菌J10,其乙酸乙酯产量为3.119g/L。根据对该乙酸乙酯产生菌的形态学特征和5.8S rDNA-ITS序列分析,鉴定该菌为异常毕赤酵母。通过采用单因素和正交实验对该菌发酵条件进行优化,获得该菌的最佳发酵条件:小麦糖化液起始糖度10°Bx,pH4.0,发酵温度28℃,发酵时间3d。在此优化条件下,乙酸乙酯产量达8.05g/L,比优化前提高158.04%。

豉香型白酒,乙酸乙酯,异常毕赤酵母,发酵条件优化

乙酸乙酯作为白酒的重要香味物质,主要由微生物特别是产酯酵母代谢产生,它能使酒体更加香醇,其含量对白酒的品质有重要影响。豉香型白酒是主产于我国珠三角地区的小曲酒,酒体玉洁冰清,豉香独特,醇和甘滑,余味爽净,在岭南地区及华侨界享有盛誉[1]。由于生产工艺独特,豉香型白酒中以乙酸乙酯为主的酯类含量较低,风味上与其他白酒有较大差异[2]。利用产酯酵母提高乙酸乙酯等风味物质的产量,对于提升豉香型白酒的感官品质有重要意义[3]。

近年来,有关产酯酵母的研究主要集中在从酒曲中分离产酯酵母,并将其应用于浓、清、特、老白干等香型的白酒生产中,对提高不同香型白酒的总酯、四大乙酯和丙酸乙酯含量、使酒体醇厚、诸香协调等方面起到了较好效果[4-9],在小曲酒中的应用也刚刚起步,董士伟等筛选出产酯酵母用于豉香型白酒提香,产乙酸乙酯达1.39g/L,取得一定效果[3];胡家俊等从小曲中分离得到多株产乙酸乙酯酵母,最高产酯量为0.465g/L[10]。为了进一步提高豉香型酒中乙酸乙酯含量,本研究从豉香型白酒酒饼中分离产酯酵母,并应用5.8S rDNA-ITS分析方法进行快速鉴定,通过优化发酵条件,提升产酯酵母的产酯能力,为后续工艺改进提供优良的菌种资源,以达到提高豉香型白酒品质、生产优质豉香型白酒的目的。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

酒饼 广东省九江酒厂有限公司提供,以自然接种酒丸制成。

分离培养基 葡萄糖20g,酵母膏10g,蛋白胨20g,琼脂20g,蒸馏水定容到1000mL,115℃,灭菌20min;发酵培养基 取适量小麦经研磨后装入1L三角瓶中,加入适量自来水,煮沸30min使之充分糊化,将糊化液置于60℃恒温水浴锅中,加入1g糖化酶保温糖化2h,然后离心过滤,得上清糖化醪,保证糖化醪培养基的糖度高于12°Bx,冷藏待用。

生化培养箱 LRH-250A型,广东省医疗器械厂;手持折光仪 WYT型,成都光学厂;pH计 pHS-25型,上海伟业仪器厂;气相色谱仪 GC17A型,岛津分析仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 分离初筛 采用稀释涂布法将酒饼菌悬液进行稀释涂布:称1g酒饼加入100mL无菌水中混合均匀,以10倍稀释法稀释至10-7,取稀释菌液0.1mL分别涂布于分离培养基平板上,于30℃培养48h;根据菌落形态及镜检结果,确定初筛菌株,经划线分纯后分别斜面保存备用。

1.2.2 复筛 闻香：对初筛纯化的菌株进行小麦糖化液固体培养并嗅闻评定,记录各菌株酯香味(香蕉、苹果等香味)的强弱;产物检测 将初筛菌株于发酵培养基中进行液体培养,检测乙酸乙酯和总酯生成量。

1.2.3 基于5.8S rDNA-ITS序列的分子鉴定

1.2.3.1 基因组DNA提取 具体方法参照文献[11]。

1.2.3.2 5.8S rDNA-ITS测序 以基因组DNA为模板,使用酵母菌5.8S rDNA-ITS通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)进行PCR,产物经1%琼脂糖凝胶电泳后,回收纯化产物,由上海美吉生物医药科技有限公司完成测序。

1.2.3.3 系统发育分析 将测序获得的酵母J10的5.8S rDNA-ITS序列与GenBank核酸数据库进行BLAST比对分析,用Clustal W和MEGA Neighbor-Joining法构建系统发育树,对进化树进行亲缘关系和系统发育评估分析。

1.2.4 发酵性能研究

1.2.4.1 装液量对J10总酯产量的影响 250mL三角瓶分别装50、100、150、200mL 12°Bx小麦糖化液,接入2%活化种子液,摇匀,30℃静置培养5d,进行总酯检测分析。

1.2.4.2 转速对J10总酯产量的影响 装有100mL 12°Bx小麦糖化液的250mL三角瓶中接入2%活化种子液,摇匀,用八层纱布封口,分别以转速0(静置)、50、100、150r/min30℃培养5d,进行总酯检测分析。

1.2.4.3 初始糖度对总酯产量的影响 分别取糖度为6、8、10、12、14°Bx、pH6.0的小麦糖化液100mL接种2%活化种子液,于30℃静置培养5d,进行总酯检测分析。

1.2.4.4 pH对总酯产量的影响 分别取pH为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0的12°Bx小麦糖化液100mL接种2%活化种子液,于30℃静置培养5d,进行总酯检测分析。

1.2.4.5 发酵时间对总酯产量的影响 在100mL 12°Bx,pH6.0的小麦糖化液中接入2%种子液,于30℃静置培养不同的时间(2、3、4、5、6、7d),进行总酯检测分析。

1.2.4.6 发酵温度对总酯产量的影响 在100mL 12°Bx,pH6.0的小麦糖化液中接入2%种子液,于不同温度(22、25、28、30、32℃)静置培养5d,进行总酯检测分析。

1.2.4.7 底物对总酯产量的影响 在100mL 12°Bx,pH6.0的小麦糖化液中接入2%种子液,分别添加2%乙醇,0.2%乙酸和0.1%磷酸二氢钾,于30℃静置培养5d,进行总酯检测分析。

1.2.4.8 接种量对产酯的影响 分别在100mL 12°Bx,pH6.0,酒精度为2%vol的小麦糖化液中按1%、2%、3%、4%、5%、6%(v:v)的比例接入活化种子液,于30℃静置培养5d,样品进行检测分析。

1.2.4.9 产酯发酵条件优化 根据上述单因素实验结果,选择影响菌体生长和总酯产量较为显著的培养基初始糖度、pH、发酵温度和时间为考察因素,按L9(34)进行正交实验(见表1),以总酯产量为检测指标,确定最优发酵条件。

表1 正交实验设计因素水平表Table 1 Factors and levels in the orthogonal experiments

1.2.5 乙酸乙酯和总酯的测定 参照国标GB/T10345-2007指示剂法[12]。

1.3 数字统计分析

本研究使用SPSS16.0软件对正交设计实验结果进行分析。

2 结果与分析

2.1 酵母的筛选

经过分离培养基筛选分离得到15株疑似酵母菌,分属五种不同的形态,各选1个代表菌株进行形态和理化指标检测,结果见表2。

表2表明,在供试的5株酵母菌中,菌株J10产酯最高,总酯达3.298g/L,乙酸乙酯含量为3.119g/L,占总酯量的94.57%,显著高于其它菌株;进一步观察其菌落和细胞形态:菌落直径1～1.5mm,有水果香;液态培养表面有菌膜,皱纹较细、薄,形成沉淀,液体澄清;镜检细胞形态为圆形至椭圆形,芽殖,无菌丝。

2.2 5.8S rDNA-ITS分析

2.2.1 PCR扩增及测序 样品DNA成功地扩增出约600bp的片段(见图1),与酵母预期5.8S rDNA-ITS目的片段长度相符,且无非特异性条带,空白对照为阴性。将目标条带进行切胶回收,送公司测序。

表2 酵母的菌落形态及理化指标Table 2 The colonial morphology and physicochemical property of yeast

注：*“-”表示乙酸乙酯含量较低,没有进行气相检测。

图1 菌株J10 5.8S rDNA-ITS PCR扩增结果Fig.1 PCR amplification of 5.8S rDNA-ITS of J10注：M:Marker DL2000,泳道1:J10,泳道2:阴性对照。

2.2.2 测序结果 通过测序得知扩增的DNA片段分子大小为618bp,且测序结果如下:

2.2.3 系统发育分析及鉴定 将菌株J10的5.8S rDNA-ITS序列与GenBank核酸数据库中的序列进行BLAST比对,结果显示该序列与10个菌株的同源序列的同源性均高达99%以上,具有高度的相似性。以酿酒酵母Saccharomycescerevisiae的同源序列为外群,将供试菌株J10和10个最相似菌株的5.8S rDNA-ITS序列构建系统发育进化树,如图2所示。10个菌株与J10聚为一类,因Wickerhamomycesanomalus和Pichiaanomala为同物异名[13],结合菌落形态及显微观察结果,确定J10属于Wickerhamomycesanomalus。

图2 基于5.8SrDNA-ITS序列的NJ系统树Fig.2 Phylogenetic tree constructed with 5.8S rDNA-ITS using the neighbor-joining method

2.3 J10产酯发酵性能研究

2.3.1 不同装液量和转速对J10总酯产量的影响 发酵过程中装液量和转速对Jl0产酯的影响分别见图3、图4。由图3可知,装液量对J10产酯效果影响显著,随着装液量的增加,产酯量逐渐增大,装液量为100mL(装液系数为0.4)时产酯量达到最大,而随后又随着装液量的增加而递减,表明装液量为100mL(装液系数为0.4)时最利于J10的产酯培养;图4表明:装液量为100mL时Jl0静置培养的产酯能力明显高于摇床培养,产酯量达到3.34g/L,随着转速的增加,产酯明显呈下降趋势。可能原因如隋延铎[14]在研究产酯酵母产酯条件时指出,产酯酵母在繁殖及产酯时均需要一定量的氧气,但供氧量过大会阻止产酯作用的进行。

图3 不同装液量对J10总酯产量的影响(n=3)Fig.3 Effects of liquid medium volume on the yield of total ester(n=3)

图4 不同转速对J10总酯产量的影响(n=3)Fig.4 Effect of rotation speeds on the yield of total ester(n=3)

2.3.2 初始糖度对总酯产量的影响 由图5可知,随着初始糖度的增加,发酵液总酯产量不断上升,当糖度为12.0°Bx时产量达到3.14g/L,表明菌株J10发酵产酯的最佳初始糖度为12.0°Bx。

图5 初始糖度对总酯产量的影响(n=3)Fig.5 Effect of initial concentration of sugar on the yield of total ester(n=3)

2.3.3 pH对总酯产量的影响 不同pH对总酯产量的影响见图6。发酵液pH主要影响发酵过程中各种酶的活性。图6表明,培养基初始pH在3.0时,总酯产量达到最大值,为4.23g/L,但随着pH增大总酯生成量减少,本研究表明产酯酵母在较低pH下,能够产生大量的酯类,这与关阳等对产酯酵母特性的研究结果基本是一致的[15]。

图6 pH对总酯产量的影响(n=3)Fig.6 Effect of pH on the yield of total ester(n=3)

2.3.4 发酵时间对总酯产量的影响 发酵时间对总酯产量的影响见图7。由图7可知,发酵3d时总酯产量最高,为4.58g/L。但随着发酵时间延长,总酯产量逐渐减少,与廖永红等[16]在对3种产酯酵母总酯的生成特性研究时发现的结论一致,其可能原因是随发酵时间延长,在发酵中难挥发性酯类也逐渐转变为易挥发性酯类或其他物质所致,因此J10合成总酯的适宜发酵时间为3d。

图7 发酵时间对总酯产量的影响(n=3)Fig.7 Effect of fermentation time on the yield of total ester(n=3)

2.3.5 发酵温度对总酯产量的影响 不同温度对总酯产量的影响见图8。图8表明,发酵温度在25℃时总酯产量最大,达5.13g/L,表明在较低温度下发酵有利于产酯酵母的产酯。

图8 发酵温度对总酯产量的影响(n=3)Fig.8 Effect of fermentation temperature on the yield of total ester(n=3)

2.3.6 不同底物对总酯产量的影响 由图9可知,分别添加乙醇、乙酸和磷酸二氢钾均可提高总酯产量,但发酵液里共同添加乙醇、乙酸和磷酸二氢钾最有利于总酯的形成,其总酯产量达5.03g/L。在培养基中添加乙醇、乙酸和磷酸二氢钾等底物明显利于产酯酵母发酵产酯,分析原因可能与产酯酵母酯酶代谢合成酯类的机制密切相关。产酯酵母能耐受一定浓度的酒精,能以乙醇作为碳源正常生长代谢,且有较强的氧化特性,从而促进了产酯酵母的呼吸作用[17];乙酸是形成乙酸乙酯的重要底物,而磷酸根离子是微生物生长繁殖和代谢的必需成分,适宜的磷含量有利于产酯酵母代谢形成酯类。因此,可以通过在发酵液中适当添加乙醇、乙酸和磷酸二氢钾等成分,提高产酯酵母产酯能力,促进白酒提香和增强后味。

图9 不同底物对总酯产量的影响(n=3)Fig.9 Effect of the substrate on the yield of total ester(n=3)注：1:CK;2:乙醇;3:乙酸;4:乙醇+乙酸; 5:磷酸二氢钾;6:乙醇+乙酸+磷酸二氢钾。

2.3.7 接种量对总酯产量的影响 接种量对总酯产量的影响见图10。适宜的接种量有利于菌体合理利用有限的营养物质进行大量繁殖。由图10可知,总酯的产量随着接种量的增大而升高,但当接种量大于4%时,总酯产量降低。因此,菌株J10合成总酯的适宜接种量是4%。

表3 发酵条件正交实验结果Table 3 The results in the orthogonal

表4 正交设计方差分析表Table 4 Analysis of variance of orthogonal test

#,注:**表示该指标影响极显著。

图10 接种量对总酯产量的影响(n=3)Fig.10 Effect of inoculating rate on the yield of total ester(n=3)

2.3.8 产酯发酵条件优化 根据单因素对产酯影响的极差值,选择对产酯影响较为显著的四个因素,即培养基的初始糖度、pH、发酵温度和时间,采用L9(34)正交实验考察其对J10菌株合成总酯的影响,结果见表3和表4。

由表3极差分析和表4方差分析可知,在发酵过程中,对J10菌株总酯产量影响的因素大小为B pH>D时间>A糖度>C温度,四个因素对总酯的产量影响均达极显著(p<0.01)。同时从表3可以得出J10生成总酯的最优组合为A1B3C3D2,即培养基的初始糖度为10°Bx,pH为4.0,发酵温度为28℃,发酵时间为3d,接种量为4%,添加2%乙醇,0.2%乙酸和0.1%磷酸二氢钾作为发酵底物。

经验证,在该条件下,总酯的生成量可达8.51g/L,乙酸乙酯的产量为8.05g/L,比优化前提高了158.04%。

3 结论

目前应用于白酒中的产酯酵母多属于汉逊酵母属、产朊酵母属、假丝酵母属和球拟酵母属等[18-19],本研究分离鉴定的产酯酵母J10为异常毕赤酵母,通过对Jl0的发酵条件进行优化,其总酯产量可达8.51g/L,乙酸乙酯8.05g/L,比优化前提高了158.04%,与已报道的同类菌相比[9,20-21],有较强的产乙酸乙酯能力,是白酒生香的重要菌种,具有较好的应用前景。有研究表明[22-23],异常毕赤酵母能耐受低pH、低水分活度、高渗透压、厌氧等极端环境,相比有氧,限氧条件不仅能够诱导异常毕赤酵母进行酒精发酵,激活发酵途径中的关键酶,而且对葡萄糖的吸收率和乙醇、甘油、乙酸乙酯等代谢物含量都有所增加。本研究为豉香型白酒的品质提升提供了优良的菌种资源,有关其在豉香型白酒中的应用还需进一步研究。

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食盐生产限额年度计划审批取消 盐业去行政化

国务院再取消49项非行政许可审批事项，今后不再保留“非行政许可审批”这一审批类别。至此，国务院部门非行政许可审批事项清理工作全面完成，“非行政许可审批”这一概念退出了历史舞台，其中就包括食盐生产限额年度计划审批、食盐分配调拨计划和干线运输计划审批。业内认为，食盐生产配额取消后，企业将根据市场供求关系生产产品，逐渐发挥市场配置资源的作用，为将来的盐业市场化改革打下基础。

我国盐业市场行政色彩一直比较浓重，目前省、市、县三级盐务管理局，不仅具有区域内盐业监管、计划调配职能，还掌握着食盐的经销业务。而经销业务则由管理局的另一块牌子“盐业公司”来负责。盐务管理局与盐业公司“两块牌子，同一套班子”，在食盐专营体制下，既是“裁判”又是“运动员”。

除了相关体制改革外，食盐价格改革也是市场关注的焦点。国家发改委发布《中央定价目录》(征求意见稿)，向社会公开征求意见，与2001年版中央定价目录相比，新的目录中定价种类约减少46%，具体项目约减少80%，但备受关注的食盐价格仍然没有放开。

来源：中国食品科技网

Isolation and identification of a high-yield ethyl acetate yeast from xiaoqu of Soybean-flavor liquor and its fermentation characterization

HUANG Guang-jian1,XU Xue-feng1,+,GUO Mei-jun2,CAO Jin1,YANG You-hui1,*

(1.College of Food Science,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China;2.Guangdong Jiujiang Distillery Company Limited,Foshan 528203,China)

A high-yield ethyl acetate yeast J10 was isolated from the xiaoqu of soy-flavor liquor by screening and ethyl acetate analysis. The highest ethyl acetate was observed as 3.119g/L. According to the morphological properties and 5.8S rDNA-ITS sequence analysis of J10,the strain was identified asWickerhamomycesanomalus. Furthermore,the single factor and orthogonal experiments were adopted to optimize the fermentation conditions of J10. The initial concentration of wheat hydrolyzed liquid was 10°Bx,pH4.0,and J10 was fermented at 28℃ for 3d. The highest ethyl acetate of 8.05g/L was achieved after the optimization. It’s higher 158.04% than that of the control.

soybean-flavor liquor;ethyl acetate;Wickerhamomycesanomalus;optimization of fermentation process

2014-08-25 +并列第一作者。

黄光建(1987-),男,硕士,研究方向:发酵工程、酿酒。 徐学锋(1977-),男,博士,副教授,研究方向:应用微生物学。

*通讯作者:杨幼慧(1956-),女,硕士,教授,研究方向:发酵工程、酿酒。

国家科技部农业科技成果转化资金项目(2012E0002005)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)11-0153-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.11.022