绿茶多糖的乙酰化修饰及其清除自由基、活性的研究

2015-05-05梁少茹

食品工业科技 2015年11期

关键词：吸光乙酰化绿茶

梁少茹,肖霄,肖斌,*

(1.西北农林科技大学园艺学院 ,陕西杨陵 712100;2.北京林业大学林木生物质化学北京市重点实验室 ,北京 100083)

梁少茹1,肖霄2,肖斌1,*

(1.西北农林科技大学园艺学院 ,陕西杨陵 712100;2.北京林业大学林木生物质化学北京市重点实验室 ,北京 100083)

绿茶多糖,乙酰化,自由基,亚硝基,清除活性

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

绿茶来自西北农林科技大学茶叶实验站;无水乙醇、95%乙醇、氯仿、正丁醇、乙醚、丙酮、氢氧化钠、过氧化氢、乙酸酐、邻二氮菲、邻苯三酚、无水对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺、硫酸亚铁、亚硝酸钠、盐酸羟胺、柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸二氢钾、醋酸钠等试剂均为国产分析纯。

AL-204分析天平电子天平梅特勒-托利多(上海)仪器有限公司;UV3802准双光束紫外可见分光光度计上海尤尼柯仪器有限公司;SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵郑州长城科工贸有限公司;RE-52AA旋转蒸发仪上海亚荣生化仪器厂;DK-S26型电热恒温水浴锅上海森信实验仪器有限公司;TGL-18M高速冷冻离心机上海卢湘仪离心机仪器有限公司等。

1.2 实验方法

1.2.1 绿茶多糖的提取与纯化绿茶多糖的提取与纯化方法[10-11]如下:绿茶茶叶粉碎,过30目筛,按茶水比1∶20在55℃下水浸提2.5h,趁热过滤,55℃温度条件下减压浓缩至原体积的三分之一,加入3倍体积95%乙醇沉淀,沉淀物用丙酮、无水乙醇、乙醚交替洗涤3次,经Sevag 法脱蛋白、过氧化氢脱色,再经透析后冻干即为纯化茶多糖(TPS)。

1.2.2 茶多糖的乙酰化修饰及最佳修饰条件确定茶多糖乙酰化修饰方法[8]如下:取绿茶多糖样品0.5g加入到10mL蒸馏水中并混匀,用0.5mol/L氢氧化钠调pH为9.0,一定温度(20～40℃)保温,其间交替向溶液中加入一定量的乙酸酐和0.5mol/L的氢氧化钠以保持溶液pH为8.0。反应期间温度控制在20～40℃,乙酸酐加入量为10～20mL,保温时间为3～5h。反应结束后,用5mol/L盐酸调整溶液的pH为7.0,冷却后将混合液置于透析袋中流水透析3d,再经减压浓缩、醇沉、冷冻干燥后即得乙酰化茶多糖(Acetylated tea polysaccharides,A-TPS)。乙酰化多糖的取代度采用碱性羟胺比色法[12]进行测定,先绘制乙酰基浓度与其吸光度(A=540nm)的标准曲线,测出样品中乙酰基含量,然后计算取代度。取代度计算公式:

式中,W为茶多糖中乙酰基含量。

通过分析比较,保温时间(A)、茶多糖与乙酸酐的体积比(B)、反应温度(C)是影响反应进程的主要因素[13],以取代度为指标,通过单因素实验对各因素进行考察,得出各因素水平取值。选择这3个指标作为实验三因素,设计三因素三水平的正交实验,参照上述乙酰化茶多糖修饰方法,按L9(34)正交表进行实验,研究得到最高取代度乙酰化茶多糖的反应条件。正交实验因素水平表见表1。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels

超氧阴离子清除率=(A0-A1)/A0×100%

式中,A0为对照组吸光值,A1为样品组吸光值。

1.2.4 茶多糖及其乙酰化产物清除羟自由基(·OH)活性的测定茶多糖及其乙酰化产物清除·OH活性的测定采用邻二氮菲-Fe氧化法[15]进行:精确移取5mmol/L邻二氮菲溶液(用蒸馏水将50mmol/L邻二氮菲无水乙醇溶液稀释制得)1.5mL,加入50mmol/L pH7.4磷酸缓冲液2.0mL,充分混匀,滴加1.0mL 7.5mmol/L FeSO4溶液,加好后立即混匀,分别加1mL不同浓度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL)茶多糖或其乙酰化产物溶液,最后加0.1% H2O21.0mL启动反应,以水补充体积至10mL作为样品管,损伤管中加H2O2不加样品溶液,未损伤管两者均不加,损伤管、未损伤管均以水补充体积至10mL,各管反应液均置于37℃保温60min,取出后在波长536nm处测吸光值。根据下式计算羟自由基清除率:

羟自由基清除率=(A2-A1)/(A0-A1)×100%

式中,A0为未损伤管吸光值,A1为损伤管吸光值,A2为样品管吸光值。

1.2.6 数据处理正交实验结果分析用Minitab15进行分析,使用SPSS statistics 19进行显著性分析,文中其他图表使用EXCEL完成。

2 结果与分析

2.1 乙酰化茶多糖的合成制备及修饰条件的优化

水提醇沉法提取绿茶多糖得粗茶多糖提取率为2.07%,经过脱色和6次除蛋白得到初步纯化茶多糖。以保温时间(A)、茶多糖质量与乙酸酐体积比(B)、反应温度(C)作为实验三因素,以制得的纯化多糖为原料,参照表1各因素水平进行正交实验。表2为实验因素水平表和正交实验结果及极差分析表,正交实验重复三次,表2中取代度为三次实验平均值。

表2 正交实验结果及极差分析表Table 2 Results of orthogonal test and range analysis

由表2可知,三个实验因素对取代度的影响作用由大到小依次为:茶多糖质量与乙酸酐体积比(B)>保温时间(A)>反应温度(C),正交实验得到的最适条件为茶多糖质量与乙酸酐体积比为1∶40,保温时间4h,反应温度为30℃。在最优条件下进行验证实验,制得乙酰化茶多糖的取代度为0.337,表明该优选条件稳定可行,重复性良好。以该正交实验获得的最佳反应条件制取乙酰化茶多糖,并进行以下清除自由基及亚硝基的实验。

图1 茶多糖与乙酰化茶多糖对超氧阴离子自由基的清除作用Fig.1 Superoxide anion free radical scavenging effect of TPS and acetylated TPS

2.3 茶多糖及乙酰化茶多糖对羟自由基(·OH)的清除作用

羟自由基是一种氧化活性很强的氧化剂,可直接损伤各种生物膜,导致多种疾病的发生,·OH清除率是抗氧化作用的重要指标[3]。本实验采用邻二氮菲-Fe氧化法测定绿茶多糖及其乙酰化产物对·OH的清除作用,实验结果见图2。

图2 绿茶多糖与乙酰化绿茶多糖对羟自由基的清除作用Fig.2 Hydroxyl free radical scavenging effect of TPS and acetylated TPS

由图2可知,茶多糖及其乙酰化产物对·OH的清除作用与溶液浓度正相关,且乙酰化茶多糖清除活性均高于未修饰前,·OH清除活性最大提高率达36.96%。此外,当溶液浓度为本实验范围内最大即1mg/mL时,乙酰化茶多糖的·OH清除率达到最大值60.36%,说明乙酰化茶多糖具有较强的·OH清除活性，表明乙酰化修饰能够有效地提高茶多糖对·OH的清除活性。

图3 绿茶多糖与乙酰化绿茶多糖对亚硝基的清除作用Fig. scavenging effect of TPS and acetylated TPS

图4 乙酰化修饰茶多糖取代度与清除活性的关系Fig.4 Relationship between modification degree and scavenging effect of acetylated tea polysaccharides

3 讨论

4 结论

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LIANG Shao-ru1,XIAO Xiao2,XIAO Bin1，*

(1.College of Horticulture,Northwest A&F University,Yangling 712100,China;2.Beijing Key Laboratory of Lignocellulosic Chemistry,Beijing Forestry University,Beijing 100083,China)