黑果枸杞中多酚的体外消化及其抗氧化性研究

楼舒婷,林雯雯,孙玉敬,李 昕,潘俊娴,叶兴乾,3,*

(1.浙江大学生物系统工程与食品科学学院,浙江杭州 310058;2.浙江工业大学海洋学院食品系,浙江杭州 310014;3.馥莉食品研究院,浙江杭州 310058)

黑果枸杞中多酚的体外消化及其抗氧化性研究

楼舒婷1,林雯雯1,孙玉敬2,李 昕1,潘俊娴1,叶兴乾1,3,*

(1.浙江大学生物系统工程与食品科学学院,浙江杭州 310058;2.浙江工业大学海洋学院食品系,浙江杭州 310014;3.馥莉食品研究院,浙江杭州 310058)

以黑果枸杞为原料,研究了化学提取法和体外消化法两种不同提取方式对多酚含量的影响。同时,采用DPPH、FRAP、ABTS和ORAC四种不同方法测定了枸杞提取物的抗氧化性。结果表明,体外消化处理后的总酚和总花色苷含量低于化学提取法,而酚酸含量则高于后者;总体上,化学提取法的抗氧化性高于体外消化法;两种提取方法处理后的总酚和总花色苷与各化学抗氧化值均有较高的线性相关性(R2>0.83)。而体外消化法中,酚酸与各化学抗氧化值的相关性(R2>0.68)明显高于化学提取法(R2>0.03)。

黑果枸杞,多酚,体外消化,抗氧化作用

黑果枸杞(LyciumruthenicumMurr.)为茄科(Solanceae)枸杞属(LyciumL.),主要分布于我国青海、新疆、宁夏、内蒙古和西藏等地区。据记载,黑果枸杞果实具有强肾润肝、明目健胃的作用,也可用于治疗心热病、心脏病、月经不调等,在民间多作为滋补强壮、降压药使用[1-2]。此外,部分地区广泛加工枸杞品种的叶片和根作为饮用泡茶[3]。

黑果枸杞果实中含有丰富的类胡萝卜素,维生素B1、维生素B2、维生素C,还富含Fe、Zn、Se等无机元素[3],其提取物也有较强的抗氧化作用[4]。但目前关于黑果枸杞果实中多酚物质体外消化的研究尚未见报道。本文研究了化学提取和体外消化两种提取方式对枸杞多酚含量的影响,并且采用常用的四种化学抗氧化方法(DPPH、FRAP、ABTS和ORAC)测定其抗氧化性,分析抗氧化作用与各酚类物质含量的相关性,为黑果枸杞在医药、营养及保健食品中的应用提供一些参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料 1,6-二(二苯基膦基)己烷(DPPH·)、水溶性维生素E(Trolox)、原儿茶素、儿茶素、咖啡酸、绿原酸等 美国Sigma公司;ABTS、AAPH、荧光素钠 阿拉丁试剂有限公司;盐酸、无水乙醇、醋酸钠 国药集团化学试剂有限公司。

枸杞来源:黑果枸杞选自常见的且产量相对丰富的新疆维吾尔自治区和青海省,同时以红果枸杞(产地新疆)作为参照对比。分别简称为新疆黑枸杞、青海黑枸杞和新疆枸杞。

1.1.2 仪器 UV-2550紫外-可见分光光度计 日本Shimadzu公司;PB-10型pH计 德国Sartorius公司;Waters2695高效液相色谱仪 美国Waters公司;Thermo Multiskan MK3酶标仪 Thermo公司;旋转蒸发器(RE-52AA) 上海亚荣生化仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 枸杞的样品制备 化学提取:取三种枸杞各2g,加入30mL 50%乙醇50℃水浴浸提1.5h,过滤后将残留物加入20mL乙醇(50%,v/v),浸提1h后过滤。合并滤液,定容至50mL。体外消化:采用Rufián-Henares等[5]和Pastoriza等人[6]的方法,并作一定优化。取三种枸杞各2g,加入20mL蒸馏水,加入α-淀粉酶/CaCl2溶液500μL(32.5mg α-淀粉酶溶解于25mL 1mmol/L CaCl2,pH7.0)。混合物在37℃振荡水浴10min后,再用6N HCl溶液将混合物调节至pH2.0,以0.05g胃蛋白酶/g样品的浓度加入胃蛋白酶,并将该混合物于37℃在振荡水浴1h。滴加0.9mol/L NaHCO3缓冲液调节至pH6.0,加入5mL胰酶-胆汁溶液(0.1g胰酶和0.625g胆汁盐溶解于25mL 0.1mol/L NaHCO3)。然后用0.9mol/L NaHCO3将pH调节至7.4,于37℃温育2h。为确保酚类化合物的稳定性,最后用6N HCl将消化产物的pH调节至2.0,10000r/min离心10min。取上清液并稀释至50mL。

1.2.2 总酚的测定 采用Bao等人的方法[7],并作一定修改。取400μL提取液,加入1mL 1mol/L福林酚试剂,并用去离子水定容至2mL。室温下暗处理5min,再加入5mL 5% Na2CO3溶液,混匀后在室温下反应1h。最后,用分光光度计在765nm下测定吸光值。实验结果表示为没食子酸当量/gDW(GAE)。

1.2.3 总花色苷的测定 取500μL待测液,分别用pH1.0的氯化钾-盐酸缓冲液和pH4.5的醋酸钠-醋酸缓冲液定容于10mL,暗处理30min后于510、700nm处测量吸光值。按照相关公式计算总花色苷含量(mg/gDW)。

A=(A510-A700)pH1.0-(A510-A700)pH4.5

式中:A510为510nm处的吸光值;A700为700nm处的吸光值;MW为矢车菊-3-葡萄糖苷分子量(449.2);DF为待测液稀释倍数;为消光系数(29600l/moL·cm);l为光路长度(cm);V为待测液体积(mL);M为样品重量(g)。

1.2.4 酚酸的测定 采用Zhou等[8]的方法,并作一定修改。取25mL提取液,用6N HCl调节至pH2.0。再采用乙醚/乙酸乙酯(1∶1,v/v)溶液萃取四次。收集水相,用无水硫酸钠干燥脱水。旋蒸至干后,用甲醇定容至2mL,过0.2μm有机滤膜,备用。高效液相色谱条件:色谱柱为LC-20高效色谱仪,迪马C18反向色谱柱(250mm×4.6mm,5μm);流动相为4%乙酸∶甲醇(20∶80,v/v);流速:1mL/min;进样量:10μL;柱温:40℃;检测器:紫外检测器;检测波长:260nm和320nm。

1.2.5 DPPH法 采用Benzie等人[9]的方法,并作一定修改。配制0.1mmol/L的DPPH·乙醇溶液,贮存于棕色瓶中。取2.8mL DPPH·乙醇溶液和0.2mL 样品溶液混合,室温下暗处理30min,于517nm波长下测定吸光度。样品抗氧化能力以抗坏血酸当量(TEAC)表示。

1.2.6 FRAP法 采用Bao等人[7]的方法,并作一定修改。配制FRAP 试剂:0.1mol/L 醋酸缓冲溶液(pH3.6)∶10mmol/L TPTZ(溶于40mmol/L盐酸)∶20mmol/L三氯化铁=10∶1∶1。取1.0mL样品提取液,加入5.0mL FRAP 试剂,反应10min后在593nm下测定吸光值。样品抗氧化能力以抗坏血酸当量(TEAC)表示。

1.2.7 ABTS法 采用Bao等人[7]的方法,并作一定修改。取440μL 140mmol/L过硫酸钾加入25mL浓度为7mmol/L的ABTS 溶液中混合,室温下暗处理12～16h,形成ABTS+自由基储备液。在波长734nm处,用50%乙醇将ABTS+自由基储备液稀释至吸光度为0.70±0.02。移取0.1mL样品提取液,加入3.9mL ABTS+溶液,室温下反应10min,于波长734nm处测定吸光值。样品抗氧化能力以抗坏血酸当量(TEAC)表示。

1.2.8 ORAC法 采用Wang等人[10]的方法,并作一定修改。配制504mmol/L荧光素钠FL溶液和17.07mmol/L AAPH溶液。在96孔板各微孔中分别加入Trolox标准溶液、样品提取液25μL及FL 25μL。在37℃下预置5 min后加入AAPH 150μL启动反应,并将孔板置于荧光酶标仪中,在37℃下以激发波长485nm、发射波长538nm进行连续测定120min,每2min测定一次各孔荧光强度。样品抗氧化能力以抗坏血酸当量(TEAC)表示。

1.3 数据统计分析

实验采用3组平行,所得数据取平均值,采用SPSS20软件进行单因素方差分析。所有的显著性分析均在p<0.05水平,利用Origin8.5软件作图。

2 结果与分析

2.1 总酚含量

从图1中可以看出,化学提取组的总酚含量总体要高于体外消化组,并且两种黑果枸杞的总酚含量高于新疆枸杞。新疆枸杞的化学提取组与体外消化组的总酚含量分别为7.85、7.76mg GAE/g DW,没有显著差异(p>0.05)。新疆黑枸杞两组的总酚含量分别为17.26、12.27mg GAE/g DW,后者下降了28.9%。而青海黑枸杞两组的总酚含量为17.40、14.47mg GAE/g DW,后者下降了16.8%。这说明并不是所有的酚类物质在消化后都能被利用,会有一部分损失。有研究表明酚类物质在小肠的碱性环境下很不稳定,有可能会转化为其他未知的物质[11]。

表1 枸杞的化学提取组和体外消化组中的自由酚酸含量Table 1 Free phenolic acids(FPA)in extracts and digesta of Lycium fruits

图1 枸杞的化学提取组和体外消化组中的总酚含量Fig.1 Total phenolic content(TPC) in extracts and digesta of Lycium fruits注：标注不同字母表示数据有显著性差异(p<0.05)，表1，图2～图6同。

2.2 总花色苷含量

如图2所示，新疆枸杞中基本未测出花色苷。相较于化学提取组(6.07mg/g DW),新疆黑枸杞体外消化组的花色苷(化学提取组6.07mg/g DW,体外消化组0.17mg/g DW)损失了近97.2%。而青海黑枸杞则是损失了87.1%(化学提取组5.90mg/g DW,体外消化组0.76mg/g DW)。

从结果可以看出,与总酚相比,花色苷在消化过程中的损失更加显著。这与先前文献报道的结果相一致:葡萄在肠胃消化后会损失90%的花色苷[12],而杨梅最高会损失59.3%[13]。这可能是因为花色苷在中性pH条件下并不稳定,发生了转化[7]。

图2 枸杞的化学提取组和体外消化组中的总花色苷含量 Fig.2 Total anthocyanin content(TAC) in extracts and digesta of Lycium fruits

2.3 酚酸含量

由表1 可知,总体上体外消化后枸杞中的自由酚酸含量较化学提取高。这说明体外消化过程中的酶解和pH变化更能够让酚酸从结合态分解为自由态[14],使得含量高于化学提取组。与其他两种枸杞相比,青海黑枸杞的酚酸含量最高(化学提取组(155.85±5.24)mg/kg DW,体外消化组(186.43±7.50)mg/kg DW),新疆枸杞与新疆黑枸杞则无显著差异(p>0.05)。

2.4 不同的抗氧化方法的影响

由于各自的抗氧化反映机理和适用的实验范围不同,四种抗氧化方法的结果存在略微差异。从图3～图6可以看出,DPPH、ABTS和ORAC法中,化学提取组中新疆黑枸杞的抗氧化性最高,新疆枸杞最低,体外消化组中青海黑枸杞最高,新疆枸杞最低;FRAP法中,化学提取组和体外消化组均是青海黑枸杞的抗氧化性最高,新疆枸杞最低。同时,除了DPPH法,体外消化组的抗氧化值均低于化学提取组,有可能是因为体外消化酶解后的酚类物质含量较低,尤其是花色苷含量大大地降低。

2.5 多酚含量与不同抗氧化方法测定值的线性相关性

表2显示了多酚含量与不同抗氧化值之间的线性关系。可以看出,化学提取组中,四种抗氧化方法与TPA、TAC有较高的线性相关性,而与FPA的相关性较低。与TPC相比,TAC与DPPH、ABTS和ORAC的线性相关度更高一些。这结果跟黑果枸杞中花色苷含量较高有关。化学提取组中FPA与抗氧化值的线性相关性最低。

在体外消化组中,TAC与抗氧化值的线性相关性(R2>0.90)比TPC(R2>0.86)更高,这说明TAC对样品抗氧化性的贡献更大。同时,与化学提取组结果(R2>0.03)不同的是,FPA与抗氧化值的线性相关性(R2>0.68)要高很多。

表2 多酚含量与不同抗氧化方法测定值的线性相关性Table 2 Coefficient of determination(R2)between antioxidant activity values and the phenolic profiles(TPC.TAC and FPA)

图3 DPPH法测定枸杞中化学提取组 和体外消化组的抗氧化性Fig.3 Antioxidant activity determined by ABTS assays of three cultivars of Lycium fruits after chemical extraction or in vitro digestion

图4 FRAP法测定枸杞中化学提取组 和体外消化组的抗氧化性Fig.4 Antioxidant activity determined by FRAP assays of f three cultivars of Lycium fruits after chemical extraction or in vitro digestion

图5 ABTS法测定枸杞中化学提取组 和体外消化组的抗氧化性Fig.5 Antioxidant activity determined by ABTS assays of three cultivars of Lycium fruits after chemical extraction or in vitro digestion

图6 ORAC法测定枸杞中化学提取组 和体外消化组的抗氧化性Fig.6 Antioxidant activity determined by ORAC assays of three cultivars of Lycium fruits after chemical extraction or in vitro digestion

3 结论

目前对于黑果枸杞的生物活性研究,包括黄酮、色素、酚酸等,均采用传统的有机溶剂提取法,但此种方法测定的活性成分含量与人体消化吸收的含量之间存在着较大的差异,不足以准确反映其实际营养价值,因此本文首次采用了体外消化法对黑果枸杞的多酚成分含量和抗氧化性进行了研究。研究发现与化学提取法相比,体外消化法提取的总酚和总花色苷含量较低,而酚酸含量则更高。这说明在体外消化过程中,不同的多酚物质在pH和酶的作用下发生了不同的变化。此外,总酚和总花色苷与各化学抗氧化值均有较高的线性相关性,而酚酸与各化学抗氧化值的相关性较低,显示出总酚和总花色苷对黑果枸杞抗氧化性的贡献更大。体外消化法主要是用消化酶处理样品,通过不同的pH变化模拟人体消化环境,其测定值比化学提取法更具有生物相关性。但为了能深入分析黑果枸杞的多酚物质在人体中的生物利用率,还需要利用细胞模型和动物模型来做进一步的研究。

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Research of bioavailability and antioxidant activity of polyphenol inLyciumruthenicumMurr

LOU Shu-ting1,LIN Wen-wen1,SUN Yu-jing2,LI Xin1,PAN Jun-xian1,YE Xing-qian1,3,*

(1.College of Biosystems Engineering and Food Science,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China；2. Department of Food Science and Technology,Ocean College,Zhejiang University of Technology,Hangzhou 310014,China;3. Fu Li Food Research Institute,Hangzhou,310058，China)

The effect of chemical extraction(i.e.,extracts)andinvitrodigestion(i.e.,digesta)method on the polyphenol content ofLyciumruthenicumMurr was investigated in this paper. Four different methods including DPPH,FRAP,ABTS,and ORAC were used to measure its antioxidant activity. The results showed that digesta had more free phenolic acids(FPA),but less total phenolic content(TPC)and total anthocyanin content(TAC)than extracts. The antioxidant activity of the extracts was higher than digesta. The correlations were high between TPC,TAC and chemical antioxidant activity(R2>0.83). FPA were better correlated with the chemical antioxidant assays in digesta(R2>0.68)than extracts(R2>0.03).

LyciumruthenicumMurr.;phenolics;invitrodigestion;antioxidant activity

2014-08-20

楼舒婷(1990-)，女，硕士研究生，研究方向：黑果枸杞的生物活性研究。

*通讯作者:叶兴乾(1962-)，男，博士，教授，研究方向：果蔬加工与工程。

国家科技支撑项目(2012BAD31B06)；浙江省重大专项(2011C160444)；浙江省科技团队项目(2010R50032)；植物食品加工技术科技创新团队(2010R50032)。

TS255.1

A

1002-0306(2015)11-0066-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.11.005