不同禽类Mel 1c基因克隆及生物信息学分析

王淑娟，刘文举，王立克，庞训胜，车传燕

(安徽科技学院 动物科学学院， 安徽 凤阳 233100)



不同禽类Mel 1c基因克隆及生物信息学分析

王淑娟，刘文举，王立克，庞训胜，车传燕

(安徽科技学院 动物科学学院， 安徽 凤阳 233100)

为进一步研究克隆到的鹅、鸭、鹌鹑、斑鸠Mel 1c 基因，对该序列进行特征分析，为Mel 1c 基因的功能研究打下基础。 参考NCBI其它物种的序列设计引物，克隆得到鹅、鸭、鹌鹑、斑鸠Mel 1c基因的部分cDNA序列，并对其编码的蛋白进行生物信息学分析。鹌鹑、鸭、鹅和斑鸠的Mel 1c部分片段，长度为850bp，编码 283个 氨基酸。通过分析鹌鹑、鸭、鹅和斑鸠Mel 1c的结构表明符合褪黑素受体的结构特征，含有一N端在胞内六个跨膜结构域，属于G蛋白偶联受体家族。该蛋白质为分泌蛋白，包含一个信号肽，其剪切位点位于26和27之间(VVA-VY)。同源性比对结果表明不同物种间Mel 1c基因序列及氨基酸序列的同源性较高均大于71%，Mel 1c在进化过程中比较保守。鹅、鹌鹑、斑鸠、鸭和原鸡的核酸和氨基酸的同源性最高分别大于92%和96%。Mel 1c符合进化规律，斑鸠、鹌鹑、鹅和鸭属于高等的非哺乳类脊椎动物，处于分子进化树的最顶层。

褪黑素受体；Mel 1c；基因克隆；生物信息学

褪黑素是松果体分泌的一个重要的激素，视网膜的光感受器也能够合成褪黑素，通过旁分泌和或胞分泌结合到视网膜褪黑素受体。褪黑素通过与其受体结合发挥调控血压[1]，调节昼夜节律[2]，调控视网膜的生理功能[3-4]，诱导肿瘤发生[3]，调控季节性繁殖[5]，调控卵巢功能[6]抗氧化功能[7]等重要的生物学作用。动物机体褪黑素的含量受昼夜节律和季节的变化影响[8-10]；一天之中，白天褪黑素的含量最低，而夜间褪黑素的含量最高，季节同样对褪黑素的分泌有重要的影响，冬季褪黑素的水平要高于夏季。褪黑素受体分为Mel 1a(也称为MT1)、Mel 1b (也称为MT2)和Mel 1c 等3种亚型，目前褪黑素受体已被证实属于G蛋白偶联受体家族成员，包含7个跨膜结构域[11]。 Mel 1a和Mel 1b存在所有的脊椎动物中，主要分布于中枢神经系统和外周组织[12]。在哺乳动物中，Mel 1a主要表达在中枢神经系统，垂体、昼夜节律位点和生殖系统[13]；Mel 1b主要表达于视网膜，介导昼夜节律的调控[14]。而Mel 1c主要存在于非哺乳类脊椎动物的脑和视网膜[15]。褪黑素的分泌受多种因素影响，进而影响褪黑素对受体的结合，发挥不同的生理功能。褪黑素受体的表达和功能受到多种因素调控，比如日夜循环，褪黑素，激素，内源性的心率节律等[8-9]。褪黑素受体在脑、肾、肾上腺、肠、胃、心脏、肺、皮肤、睾丸及卵巢周边组织均有表达，在视交叉上核及脑的表达量最高。褪黑素受体不同亚型在不同物种中的表达分布及定位具有差异[16],褪黑素受体在神经系统及周边组织广泛分布，这与褪黑素对神经内分泌的调节及生理效应以及对昼夜节律的调节有着重要的关系[17]。褪黑素通过调节下丘脑-垂体-性腺轴，进而调节季节性繁殖性动物的生殖功能，而对非季节性繁殖动物亦有重要的调节作用[18]。褪黑素直接调节卵巢的功能通过激活颗粒细胞及卵泡的多重受体及信号通路褪黑素可以调节禽类的昼夜节律、睡眠、体温和神经内分泌[19]。褪黑激素对牛的颗粒细胞具有抗凋亡作用[20]。本试验通过RT-PCR的方法克隆鹅、鸭、鹌鹑、斑鸠的Mel 1c基因序列，并对该序列进行生物信息学分析，为研究Mel 1c在不同物种中的定位分布以及生物学功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验对象 成年母鹅、母鸭、鹌鹑、斑鸠各1只，取新鲜脑组织于液氮中保存备用。

1.1.2 主要试剂 总RNA提取试剂盒(购自北京索莱宝)、M-MLV RT反转录酶、Taq DNA 聚合酶等(均购自fermentas)、dNTP Mix(购自天根公司)、DNA回收试剂盒(购自上海生工公司)、pMD18-T载体(购自TaKaRa)，质粒小提试剂盒(购自天根公司)。

1.2 方法

1.2.1 脑组织总RNA提取与反转录 采用RNA提取试剂盒提取冻存于液氮中的脑组织中的总RNA，-80℃保存备用。以提取的总RNA 为模板反转录获得cDNA。反转录程序及条件：5μL总RNA、0.5μL Oligo(dT) Primer，70℃ 5min，迅速置于冰上预冷2min；然后加入11.75μL Rnasefree-H2O、5μL M-MLV RT 5×Buffer、1.25μL dNTP、0.5μL RNasin Ribonuclease Inhibitor和1μL M-MLV Reverse Transcriptase，42℃ 60min，72℃ 10min，得到cDNA，置于-20℃冰箱备用。

1.2.2 PCR扩增 参考GeneBank报道的原鸡(Gallus, NM_205361)、金鱼(Carassius auratus, AB481375)、斑马鱼(Danio rerio, NM_001161484)、狼鲈(Dicentrarchus labrax, EU378920)、点带石斑鱼(Epinephelus coioides, JX524510)、香鱼(Plecoglossus altivelis, AB481370)、点篮子鱼(Siganus guttatus, DQ768088)、塞内加尔鳎(Solea?senegalensis, FM213465)和蟾蜍(Xenopus laevis, XLU67880) Mel 1c基因序列，针对序列保守区域利用Primer5.0软件优化设计2对引物。引物由上海生工公司合成。

表1 鹅、鸭、鹌鹑和斑鸠Mel 1c基因扩增引物

以合成的cDNA第一链为模版进行目的基因的扩增，PCR反应体系为：2μL cDNA、引物(10μmol/L)各0.8μL、0.5μL dNTP (10mM)、2.5μL 10×Buffer、0.5μL Taq酶(5U/μL),加dd H2O补至20μL。

反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，退火30s，72℃延伸1min，进行30个循环；最后72℃延伸10min，PCR产物保存在4℃。PCR扩增产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下观察切下目的片段，用凝胶回收试剂盒回收目的片段。

1.2.3 PCR产物的克隆与鉴定 将目的片段与pMD18-T克隆载体连接。连接体系：0.3μL pMD18-T vector、2.5μL SolutionⅠ、7.2μLDNA回收产物，混合，4℃连接过夜。连接产物转化DH5α，铺含Amp+LB琼脂糖培养基上，37℃培养12h。挑取单菌落，小量培养，用质粒小提试剂盒提取质粒，然后以质粒为模板用PCR鉴定重组质粒。

1.2.4 测序与分析 选PCR鉴定正确的质粒进行测序鉴定。测序由上海生工生物工程有限公司完成。

1.2.5 生物信息学分析 氨基酸序列通过expasy软件翻译获得(http://www.expasy.ch/tools/dna.html)，采用NCBI 的BLAST工具比对序列的同源性(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，通过ClustalW程序构建分子进化树(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)。利用SignalP-4.0进行Mel 1c蛋白信号肽预测。利用TMHMM Serverv.2.0对蛋白进行跨膜区分析(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)。

2 结果与分析

2.1 重组质粒pMD18-T-Mel1c的鉴定

对挑取的单菌落进行PCR鉴定，鉴定结果如图1，从阳性克隆中，挑选任一个进行序列测定。

2.2 核苷酸和氨基酸序列分析结果

鹅、鸭、鹌鹑和斑鸠的RT-PCR扩增产物测序结果片段均为850bp(图1)。对获得的序列在GeneBank上进行Blast比对分析，发现为Mel 1c基因的部分cDNA序列。该编码区与已报道动物的Mel 1c具有较高的同源性。由ExPASy的ProtParamToo软件分析该片段共编码283个氨基酸，且为疏水性。另外还预测该蛋白质为分泌蛋白，包含一个信号肽，其剪切位点位于26和27之间(VVA-VY)(图2)；而且该蛋白具有G蛋白偶联受体家簇1的结构域(1-244)，含六个强的跨膜螺旋结构(图3)；这些蛋白含有褪黑素受体的典型特征：在第二个跨膜区的下游含有NRY基本单元，在第六个跨膜区含有NAXXY(X为除了脯氨酸外的任意氨基酸)基本单元。对维持哺乳动物褪黑素受体1a重要功能的氨基酸已被加灰色背景(图4)。经亚细胞定位分析预测其可能位于浆膜、高尔基体或内质网。

鹅、鸭、鹌鹑和斑鸠Mel 1c基因部分cDAN序列和推测氨基酸序列分别与GeneBank数据库中获得的其它已知物种Mel 1c基因cDNA序列与氨基酸序列进行多序列比对(表2、表3)。结果表明，鹅、鸭、鹌鹑、斑鸠和原鸡间的核苷酸序列同源性较高达92%～98%；而和金鱼、斑马鱼、狼鲈、点带石斑鱼、香鱼、点篮子鱼、晒内加尔鳎及蟾蜍的同源性均大于71%。鹅、鸭、鹌鹑、斑鸠和原鸡间氨基酸序列的同源性在96%～98%；而和金鱼、斑马鱼、狼鲈、点带石斑鱼、香鱼、点篮子鱼、晒内加尔鳎及蟾蜍的同源性均大于75%。

Xenopus -MMEVNSTCL DCRTPGTIRT --EQDAQDSA SQGLTSALAV VLIFTIVVDV LGNILVILSV

Solea MGDELEVKDV NGSNCLSRNE --SDRGLSAS SAGVSTALAS VLIFTIVVDI LGNVLVILSV

Siganus --MDLDVEDV NGSNCVSRNE --SGRGLSAS SSGVSTALAS VLIFTIVVDI LGNVLVILSV

Plecogloss --MELEAN-L SGVHCLSHDE NGSCAAEQTS STGVSTALAS VLIFTIVVDI LGNVLVILSV

Gallus ---------M ERPGSNGSCS --GCRLEGGP AARAASGLAA VLIVTIVVDV LGNALVILSV

Epinephelu --MDLEVKDE NGSSCLSRNE --SDRGLNAS SAGVSTALAS VLIFTIVVDI LGNVLVILSV

Dicentrarc --MDLEVKDV NGSNCLSRNE --SVRGLSAS SAGVSTALAS VLIFTIVVDI LGNVLVILSV

Danio --MAMTKANL SCLDSLSQGN --NCLTARST SPGVAATLAG VLIFTTVADI VGNLLVILSV

Carassius --MELLKANL SCLDSLSPGN --NCLPARGT SPGVAATLAG VLIFTTVADI VGNLLVILSV

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Epinephelu YRNKKLRNAG NIFVVSLSVA DLVVALYPYP LVLTAIFHDD WTMGDLHCQA SGFIMGISVI

Dicentrarc YRNKKLRNAG NIFVVSLSVA DLVVALYPYP LVLTAIFHND WTMGDLHCQA SGFIMGLSVI

Danio YRNKKLRNAG NIFVVSLSVA DLVVALYPYP LALIAIFHND WTMGSLHCQL SGFIMGLSVI

Carassius YRNKKLRNAG NIFVVSLSVA DLVVALYPYP LALVAIFHNG WTMGSLHCQL SGFIMGLSVI

Coturnix LRNKKLRNAG NIFVVSLSVA DLVVAVYPYP LILSAIFHNG WTMGNVHCQI SGFLMGLSVI

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图4 鹅、鸭、鹌鹑和斑鸠的Mel1c氨基酸序列与其它脊椎动物比对

Fig.4 Deduced amino acid sequence of goose,duck,geopelia and coturnix Mel1c melatonin receptor and alignment with Mel1c from other vertebrate species.

表2 不同物种Mel 1c基因核苷酸序列同源性比较(%)

表3 不同物种Mel 1c基因氨基酸序列同源性比较(%)

2.3 分子进化树分析

由表3可见Mel 1c的氨基酸序列比对结果显示该基因比较保守，经比较分析不同物种间有相同的结构域。据此构建的分子进化树(图5)表明，Mel 1c基因符合进化规律，狼鲈(dicentrarchus labrax)是本研究中最低等的脊椎动物，位于分子进化树的最底层，而斑鸠、鹌鹑、鹅和鸭处于分子进化树的最顶层。

3 讨论

本研究成功克隆了鹌鹑、鸭、鹅和斑鸠的Mel 1c基因部分片段，长度为850bp，编码 283个 氨基酸，并对其分子特征进行分析。结果表明，鹌鹑、鸭、鹅和斑鸠的Mel 1c基因符合褪黑素受体的结构特征，属于G蛋白偶联受体家族[11]。维持褪黑素受体功能的氨基酸序列在鹌鹑、鸭、鹅和斑鸠以及其他物种之间是保守的，这些保守序列包括在跨膜结构域Ⅱ含有两个保守的丝氨酸残基，在跨膜结构域Ⅲ含有保守的缬氨酸、组氨酸和靠近的NRY残基，在跨膜结构域Ⅵ、Ⅶ分别含有保守的脯氨酸和丝氨酸。这些保守的氨基酸组成对于维持Mel 1c高级结构及生物学功能具有重要的作用[21]。

与Genebank其它物种的Mel 1c核苷酸和氨基酸序列比对发现不同物种间的Mel 1c基因核酸和氨基酸的同源性较高(分别高于71%和75%)。鹅、鹌鹑、斑鸠、鸭和原鸡的核酸和氨基酸的同源性最高(分别大于92%和96%)。鹅、鹌鹑、斑鸠、鸭和原鸡均属于禽类，所以在氨基酸和核酸的同源性上较高。氨基酸序列的比对表明Mel 1c在进化过程中比较保守。通过氨基酸序列构建分子进化树，Mel 1c符合进化规律，斑鸠、鹌鹑、鹅和鸭属于高等的非哺乳类脊椎动物，处于分子进化树的最顶层，狼鲈(dicentrarchus labrax)是本研究中最低等的非哺乳类脊椎动物，位于分子进化树的最底层。

根据Mel 1c氨基酸序列通过相应软件预测表明该蛋白质为分泌蛋白，包含一个信号肽，其剪切位点位于26和27之间(VVA-VY)。Mel 1c蛋白为具有七个跨膜结构功能蛋白，而跨膜结构多构成受体通道，执行信号传导等重要功能[22]。这种结构对于维持褪黑素调控动物的节律性及调节下丘脑-垂体-性腺轴可能具有重要的作用，褪黑素在外界光源等因素的影响下与Mel 1c结合，作为一种信号进而调控动物的昼夜节律及生殖生理活动。

本研究为Mel 1c在调控动物节律性中的作用，在不同组织中的表达分布，以及Mel 1c在禽类生殖生理中的调控研究提供基础。同时本研究通过克隆获得鹅、鹌鹑、斑鸠和鸭的Mel 1c基因序列，这为研究Mel 1c在不同物种中的遗传进化研究提供可靠的序列参考。

4 结论

本研究成功克隆了鹅、鹌鹑、斑鸠和鸭的Mel 1c基因的部分片段，并对其进行生物信息学分析。通过PCR扩增获得Mel 1c基因部分编码序列，该序列含有六个跨膜结构域，属于G蛋白偶联受体家族。该蛋白质为分泌蛋白，包含一个信号肽。与其他物种比对， Mel 1c基因同源性较高，其中鹅、鹌鹑、斑鸠、鸭和原鸡的核酸和氨基酸的同源性最高，在进化过程中比较保守。

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Cloning and Bioinformatics Analysis of Mel 1c Genes in Different Poultry

WANG Shu-juan, LIU Wen-ju, WANG Li-ke, PANG Xun-sheng, CHE Chuan-yan

(Colloge of Animal Science, Anhui Science and Technology University, Fengyang 233100, China)

The study cloned the Mel 1c gene of goose, duck, coturnix and geopelin, and analyzed the biological information of the sequence, which laid the foundation for further research on Mel 1c gene. Partial sequence of Mel 1c gene of goose, duck, coturnix and geopelin were cloned by using the sequence database of NCBI, and analyzed the biological information of Mel 1c protein. The result showed that the cloned sequences length of Mel 1c gene were 850 bp, which encoded 211 amino-acid fragment. The protein contained a cytoplasmic N-termini in the six-transmembrane domains and belong to a superfamily of G-protein coupled receptors. And it was a secreted protein containing a signal peptide, while the splice site was located between 26 and 27(VVA-VY). Compared with other species Mel 1c genes published, the homology among different species was higher than that of 71%, the gene was conserved in evolution. Meanwhile the goose, duck, coturnix and geopelin nucleotide and putative amino acid sequence homology are highest, which are more than 92% and 96% respectively. Goose, duck, coturnix and geopelin belong to non mammalian vertebrates, at the top of the phylogenetic tree, which accord with biological evolution rule. More biological information of Mel 1c gene showed that the gene belonged to melatonin receptor subtype.

Melatonin receptor; Mel 1c; Gene cloning; Bioinformatics

2015-05-03

国家自然科学基金(31301972)；安徽省自然科学基金(1308085QC66)；安徽省教育厅自然科学基金项目(kj20136077)。

王淑娟(1983-)，女，山东省荷泽市人，博士，讲师，主要从事动物生殖生理与繁殖研究。

Q71

A

1673-8772(2015)04-0001-08