截留相对分子质量1000的超滤膜优选半夏白术天麻汤方药半仿生法提取药材组合方式

徐 男 ，时海燕 ，蔡梅超

(1.山东省中医药研究院，山东 济南 250014； 2.山东省千佛山医院，山东 济南 250014；3.山东中医药大学，山东 济南 250355)

在优选出半仿生(SBE)法提取工艺条件的基础上，以天麻素、甘草次酸、高效液相色谱（HPLC）总面积、总黄酮、分子量≤1000提取物为指标综合评判，优选半夏白术天麻汤方药较佳提取组合方式。现报道如下。

1 仪器与材料

KQ－250E型医用超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；FA1100型电子分析天平(上海精密科学仪器有限公司)；Mettler AE 240型电子分析天平(瑞士梅特勒公司)；PHS2－3C型精密pH计(上海雷磁仪器厂)；LXJ－Ⅱ型离心沉淀机(上海医疗器械三厂)；箱式电阻炉(上海申光仪器仪表有限公司)；日立Μ－3010型紫外可见分光光度计；高效液相色谱仪、工作站及紫外检测器(美国Agilent公司)；血清超滤器(上海德宏生物医学科技发展有限公司)。

本试验所用中药经张兆旺教授鉴定，半夏为天南星科植物半夏 Pinellia ternate(Thunb.)Breit.的干燥块茎；天麻为兰科植物天麻 Gastrodia elata Bl.的干燥块茎；茯苓为多孔菌科真菌茯苓Poria cocos(schw.)Wolf.的干燥菌核；橘红为芸香科植物橘Citrus reticulata Blanco及其栽培变种的干燥外层果皮；白术为菊科植物白术 Atractylodes macrocephala Koidz.的干燥根茎；甘草为豆科植物甘草 Glycyrrhiza uralensis Fisch.的根及根茎。

天麻素对照品(批号110807－200205)，柚皮苷对照品(批号110722－200309)，甘草次酸对照品(批号 723－9002)，均供含量测定用，购自中国药品生物制品检定所。高效液相用甲醇、乙腈为色谱纯，水为自制高纯水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 药材组合方式

半夏白术天麻汤由6味中药组成，按君、臣、佐、使组方原则分为 4组：A 组(半夏、天麻)、B 组(白术)、C 组(茯苓、橘红)、D 组(甘草)。排列组合为 15组，分别为1号(ABCD)，2号(A＋B＋C＋D)，3号(AB＋C＋D)，4号(AC＋B＋D)，5号(AD＋B＋C)，6号(BC＋A＋D)，7号(BD＋A＋C)，8号(CD＋A＋B)，9号(AB＋CD)，10号(AC＋BD)，11号(AD ＋BC)，12 号(ABC＋D)，13号(ABD＋C)，14号(ACD＋B)，15号(BCD＋A)。其中 AB＋C＋D，即用优选出的SBE法条件提取，AB为2味中药合并提取，提取液依次粗滤，离心(3 500 r/min，25 min)，一定规格的中空纤维膜滤过；C和D分别单独提取，提取液依次粗滤，离心(3 500 r/min，25 min)，一定规格的中空纤维膜滤过，浓缩，合并3种浓缩液，定容至1000 mL。其余类推。

2.2 溶液制备

按处方比例称取 10～20目的 A，B，C，D 粗粉，按 2.1项下组合方式，用优选的SBE法工艺，分别提取3次[(加水量为中药重量的 10，8，8 倍，水的 pH 为 2.0，6.5，8.5，提取时间依次为120 min，90 min，90 min，提取液依次粗滤，离心(3 500 r/min，25 min)]，一定规格的中空纤维膜滤过，浓缩，定容至1000 mL，即得样品溶液。精密吸取样品溶液SBEE1～18各10 mL，蒸干，残渣用乙腈－水(3∶97)混合溶液溶解定容至10 mL，经 0.45 μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液 B1～18(质量浓度为 0.092 g /mL)，供天麻素含量和HPLC总面积的测定。精密吸取样品溶液SBEE1～18各25 mL，加氯仿 30 mL、盐酸 2.5 mL，水浴回流 1.5 h，用 20 mL 氯仿萃取2次，回收氯仿，甲醇定容至10 mL，经 0.45 μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液 C1～18(质量浓度为 0.23 g /mL)，供甘草次酸的测定。精密吸取样品溶液SBEE1～18各100 mL，浓缩并定容至50 mL，即得供试品溶液 D1～18(质量浓度为 18.4 g /mL)，供测定相对分子质量≤1000提取物得率和总黄酮含量。

2.3 天麻素含量测定[1－2]

色谱条件：色谱柱为DiamonsilTM(钻石)C18柱(200 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈－0.05% 磷酸(3 ∶97)；检测波长 220 nm，参比波长 360 nm；柱温 25℃；流速 1.0 mL /min；进样量 20μL。

对照品溶液制备：精密称取经80℃干燥恒重1 h的天麻素对照品4.35 mg，置 25 mL容量瓶中，加乙腈－水(3∶97)溶解并稀释至刻度，摇匀，即得天麻素对照品溶液A(0.174 g/L)，置4℃冰箱中保存。

线性关系考察：按拟订色谱条件，取天麻素对照品溶液(0.087 g /L)，分别自动进样 5，10，20，40，80 μL，测定峰面积。以对照品溶液的进样量(μg)为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线，回归方程为 Y＝1 681.2 X＋84.154，r＝0.999 9。结果表明，天麻素进样量在0.435～6.96 μg范围内与峰面积线性关系良好。

含量测定：取 2.2 项下供试品溶液 B1～18，分别进样 20 μL，记录天麻素色谱峰面积，外标一点法计算含量。结果见表1和图1。

2.4 甘草次酸含量测定[3]

色谱条件：色谱柱为 DiamonsilTM(钻石)C18柱(200 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为甲醇－0.1% 磷酸(87 ∶13)；检测波长250 nm，参比波长 360 nm；柱温 25 ℃ ；流速 1.0 mL /min；进样量20 μL。

对照品溶液制备：精密称取甘草次酸对照品2.90 mg，置100 mL容量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得甘草次酸对照品溶液 B(0.029 g /L)。

线性关系考察：按拟订色谱条件，取甘草次酸对照品溶液(0.029 g /L)，分别自动进样 5，10，20，40，60，100 μL，测定峰面积。以对照品溶液的进样量(μg)为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线，回归方程为 Y＝2 478.2 X－39.38，r＝0.999 8，直线过原点。结果表明，甘草次酸进样量在 0.145～1.740 μg范围内与峰面积线性关系良好。

表1 天麻素含量测定结果

图1 天麻素含量测定高效液相色谱图

含量测定：取 2.2 项下供试品溶液 C1～18，分别进样 20 μL，记录甘草次酸色谱峰面积，外标一点法计算含量。结果见表2和图2。

2.5 总黄酮含量测定[4－5]

对照品溶液制备：精密称取105℃干燥至恒重的柚皮苷对照品9.25 mg，置50 mL棕色容量瓶中，加蒸馏水溶解稀释至刻度，摇匀，得柚皮苷对照品溶液 C(0.185 0 mg/mL)。

标准曲线绘制：精密吸取柚皮苷对照品溶液 0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，分别置干燥具塞试管中，加入甲醇 1 mL，再加入10%KOH溶液 0.5 mL，室温放置 5 min，用甲醇稀释并定容至10mL，以甲醇作空白对照，在412 nm波长处测定吸光度。以质量浓度 C(μg/mL)为横坐标、吸光度(A)为纵坐标绘制标准曲线，回归方程为 A＝0.053 2 C ＋0.009 2，r＝0.999 8。结果表明，总黄酮质量浓度线性范围为 3.70 ～ 18.50 μg/mL。

含量测定：取 2.2项下供试品溶液 D1～18，依法测定含量。结果见表3。

2.6 HPLC积分总面积测定

色谱条件：色谱柱为 DiamonsilTM(钻石)C18柱(200 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈(A)－水(B)，线性梯度洗脱，时间程序为 0 min→45 min(A 5%→45%)，45 min→60 min(A 45%→100%)；流速 1.0 mL /min；检测波长 324 nm，参比波长 400 nm；柱温 25 ℃ ；进样量 20 μL。

HPLC积分总面积测定：精密吸取2.2项下供试品溶液B1～18，按拟订的液相色谱条件，依法测定。结果见表4和图3。

表2 甘草次酸的含量测定结果

图2 甘草次酸对照品色谱图

表3 总黄酮含量测定结果

表4 HPLC积分总面积的测定结果

图3 半夏白术天麻汤高效液相色谱图

2.7 相对分子质量1000提取物得率测定

取2.2项下供试品溶液D1～18各25 mL，平行取3份，置蒸发皿中，水浴蒸至近干，于105℃烘至恒重，计算相对分子质量≤1000提取物的得率。结果见表5。

表5 相对分子质量≤1000提取物测定结果

2.8 综合评判优选方药组合方式

将表1至表5中天麻素、甘草次酸、总黄酮、HPLC积分总面积、相对分子质量≤1000提取物得率测定的数据，按公式 X′i.j＝进行标准化处理 (Xi.j为样品液 i中成分 j的含量，Xj为 18个水平样品液 i中成分 j的平均值，Sj为成分 j的标准偏差，即为标准化后的值)。将标准化后的 X′i.j值，根据各指标在工艺选择中的主次给予不同的加权系数，以标准化后的值 X′i.j加权后求和，即得综合评价指标 Y值。Y＝(天麻素 ＋甘草次酸)/(2×5)＋(总黄酮 ＋HPLC总峰面积)/(2×3)＋相对分子质量≤1000 Da提取物 ×2，依法标准化加权求和处理。结果见表6和图4。由表6可知，第1号供试品溶液综合评判指标的 Y值最大，即本方药材以ABCD组合为较佳。

表6 各指标成分含量及标准化处理结果

图4 15种组合各指标标准化 Y值柱形图

3 讨论

中药复方提取是一个复杂的理化反应过程，方药各成分间存在相互作用，在煎提过程中可产生增溶、沉淀、催化分解、化合反应等理化现象，影响成分的提取率及药效的发挥。文献显示和实际工作经验均证明，中药中结构比较明确且具有药理作用的活性成分相对分子质量一般小于或等于1000。结合现代膜分离技术[6－10]，以此类提取物作为最终产物，不仅提取物得率大大降低，可缩小服用量，而且为选用现代药物新剂型提供了可能，同时也提高了技术含量。以相对分子质量≤1000的提取物为指标，能体现中药整体、综合、客观、模糊的特点，这是中药药效物质提取研究设计中一种新思路，对中药现代化研究很有借鉴意义。

为了研究方药组合方式对成分提取的影响，本试验对半夏白术天麻汤方药中的6味中药按君臣佐使分为4组，即A(半夏、天麻)、B(白术)、C(茯苓、橘红)、D(甘草)，再排列组合成 15 种组合方式，用优选的SBE法提取，提取液作天麻素、甘草次酸、总黄酮、HPLC积分总面积、相对分子质量≤1000提取物的测定，并对这5个指标数据作标准化处理，以消除各指标单位和量纲不同以及各指标变量范围相差悬殊所造成的影响;同时根据各指标在工艺选择中的主次，给予不同的加权系数，加权后求和得综合评判的 Y值，结果以ABCD的 Y值最大，说明该方提取时以半夏、天麻、茯苓、橘红、白术和甘草全方药混合提取为佳。

HPLC法流动相梯度洗脱中，在检测波长为324 nm、流动相一致的色谱条件下，15种药材组合方式提取液的色谱峰数及峰位基本一致，但积分值不同，表明15种药材组合方式提取出的成分基本一致，但含量不同。本研究中采用多种指标综合优选该方最佳药材组合方式，符合中医用药发挥多种成分、综合作用的特点，同时也利于用单体成分控制制剂的质量。

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