注射用醋酸西曲瑞克的非临床安全性评价

张 竞，徐晓月，何 燕

（河南省食品药品检验所，河南 郑州 450003）

西曲瑞克为新合成的促性腺激素释放激素拮抗剂，多用于接受控制性超排卵辅助生殖治疗的妇女，防止过早出现的促黄体生成激素（LH）峰及控制随后的排卵，以及治疗子宫内膜异位症[1]。笔者根据药物分类和药品注册管理办法及注射剂研制要求，按照国家食品药品监督管理总局2005年《化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》对注射用醋酸西曲瑞克的安全性进行评价，现报道如下。

1 材料

1.1 仪器与试药

CP225D型电子天平（德国Sartorius公司）；UW8200S型电子天平（日本Shimadzu公司）；SF2000型三按键电子数显卡尺（桂林广陆数字测控股份有限公司）；RTZ－10A－RT型婴儿秤（无锡市衡器厂）；GD100型恒温循环水浴锅（英国 Grant公司）；CH30型显微镜（日本Olympus公司）。注射用醋酸西曲瑞克（受试药物，开封明仁药业有限公司，规格为每瓶 0.25 mg，批号为 20120501）；注射用醋酸西曲瑞克（参比药物，德国Baxter Oncology GmbH公司，规格为每瓶 0.25 mg，批号为 1D326A）；氯化钠注射液（上海百正许昌药业有限公司，规格为每支 100 mL∶0.9 g，批号为1112001）；牛血清白蛋白（瑞士Roche公司，规格为每瓶5 g，批号为A8020）；伊文思蓝（上海化学试剂采购供应站分装厂进口分装，批号为 08－11－02）。

1.2 动物

豚鼠，体重 250～350 g，雌性（无孕），质量合格证号为41001900000173；日本大耳白家兔，体重 2.0 ～3.0 kg，雌性（无孕），质量合格证号为41001900000213；均购自河南省康达实验动物有限公司（动物试验许可证号 SCXK＜豫＞2011－0001）。动物营养饲料购自河南省实验动物中心（许可证号为 SCXK＜豫＞2010－0002）。动物单笼饲养，环境通风良好，12 h光照明暗交替，温度（23±2）℃，湿度50% ～65%。

1.3 剂量换算[2]

注射用醋酸西曲瑞克用于下腹壁皮下注射，每日1次，每次0.25 mg，用注射用水溶解。以 60 kg体重计，临床最大成人用剂量为 0.004 2 mg/kg，最大给药浓度为 0.25 g /L；豚鼠以 300 g体重计、家兔以 2.5 kg体重计，豚鼠和家兔等效剂量分别为0.022 1 mg/kg 和 0.010 2 mg /kg。

2 方法与结果

2.1 全身主动过敏性试验[2－5]

方法：取健康豚鼠24只，随机分为4组，每组6只，分别为0.9%氯化钠注射液阴性组；0.5%牛血清白蛋白阳性组；注射用醋酸西曲瑞克高剂量组，给药浓度 0.05 g /L，致敏剂量 0.083 mg /kg，激发剂量0.167 mg/kg；注射用醋酸西曲瑞克低剂量组，给药浓度0.025 g /L，致敏剂量 0.042 mg /kg，激发剂量 0.083 mg /kg。隔日每只腹腔注射供试液0.5 mL，共3次。然后将各组再均分为2组，每组3只，分别在首次注射后第14及21日，由耳缘静脉注射供试液1.0 mL进行激发。每日观察动物症状，首次、末次致敏和激发前称量动物体重。静脉注射后30 min内，按表1详细观察每只动物的症状反应、症状出现及消失的时间。最长观察3 h，并按照评价标准判断过敏反应发生程度，计算过敏反应发生率，根据过敏反应发生程度和发生率进行综合判断。

结果：阴性组和注射用醋酸西曲瑞克高、低剂量组豚鼠均未出现过敏症状，而阳性组6只豚鼠在激发后均出现过敏反应，2只为强阳性（＋＋＋），症状评分为14分和15分；4只为极强阳性（＋＋＋＋），症状评分为20分。

表1 全身主动过敏反应症状和评价标准

2.2 被动皮肤过敏性试验

抗体制备：取健康豚鼠8只，随机分成4组，每组2只，分组及给药方法同2.1项。隔日每只腹腔注射供试液0.5 mL，共3次。首次注射后第 14日自心脏采血 5 mL，2 000 r/min，离心 10 min后分离血清，每组2只豚鼠血清合并，分别制得混合抗血清，保存于－20℃环境，备用。

试验方法：取健康豚鼠24只，随机分成4组，每组 6只，分别为阴性组、阳性组、高剂量组、低剂量组。动物背部脱毛面积3 cm×4 cm，然后皮内注射各对应组的混合抗血清0.1 mL（稀释度为1∶4），进行被动致敏。24 h后各组分别耳缘静脉注射含1%伊文思蓝染料的对应供试液1.0 mL，进行激发。30 min后将动物脱臼处死，剪取背部致敏部位皮肤，测量内层蓝色反应斑的直径大小，不规则斑点的直径为长径与短径之和的一半,直径大于5 mm者判定为阳性。

结果：阴性组和注射用醋酸西曲瑞克高、低剂量组豚鼠均未出现蓝斑，为阴性；而阳性组豚鼠皮肤内层蓝斑直径均大于5 mm，分别为 14.58，15.86，15.53，18.29，14.54，17.04 mm，平均15.97 mm，为阳性。

2.3 溶血性试验[5－8]

红细胞悬液配制：取健康家兔1只，心脏取血10 mL，放入含玻璃珠的干燥三角瓶中振摇10 min，使成脱纤血液，移入刻度离心管内，加入约 10倍量 0.9%氯化钠注射液，摇匀，1 500 r/min离心15 min后倾去上清液，沉淀的红细胞再加0.9%氯化钠注射液同法反复洗涤2～3次，至上清液无色透明为止。将所得红细胞用0.9%氯化钠注射液按其容积稀释成2%的混悬液，备用。

试验方法：取洁净玻璃试管14支进行编号，1～5号管为受试药物管，7～11号管为参比药物管，6号管和12号管为供试品对照管，13号管为阴性对照管，14号管为阳性对照管。按表2所示依次加入2%红细胞悬液、0.9%氯化钠注射液、纯化水、受试药物（0.062 5 g/L，0.25 g/L 经 1 ∶3 稀释）、参比药物（0.062 5 g /L，0.25 g/L 经 1 ∶3 稀释），混匀，立即置（37±0.5）℃ 的恒温水浴锅中进行温育，观察是否有溶血和凝聚发生，开始每隔15 min观察1次，1 h后每隔1 h观察 1次，最长观察3 h。

结果：阳性对照管加入纯化水后，溶液立即呈澄明红色，管底几无红细胞残留，表明全溶血；阴性对照管上清液澄明无色，红细胞全部下沉，经振摇后可均匀分散，显微镜下观察，红细胞形态正常；3 h时肉眼观察，受试药物和参比药物注射用醋酸西曲瑞克各管红细胞沉积于试管底部，上层液无色澄明，1号试管壁上有少量红细胞黏附，经振摇后红细胞可分散；显微镜下观察，1，2，3，7，8，9号管均有红细胞聚集现象，1至3号管程度逐渐减轻，总体程度较轻，每个视野内有1～2个两两聚集的红细胞团，滴加氯化钠注射液后聚集未散，4，5，10，11号管红细胞形态正常，无聚集现象。结果见表3。

表2 加样顺序

表3 受试药物溶血性试验结果

2.4 皮下刺激性试验[2，7]

方法：取健康家兔4只，试验前24 h动物背部两侧脱毛，去毛范围每侧各约7 cm×7 cm。采用同体左右侧自身对比法，左侧背部皮下注射灭菌注射用水，右侧背部皮下注射注射用醋酸西曲瑞克 0.1 mg/kg，给药浓度为 0.25 g /L，给药容积均为每只1.0 mL。观察给药后不同时间注射局部反应情况，注射后48 h处死动物，解剖取出皮下组织，观察注射部位组织的变化，并进行局部病理组织学检查。兔皮肤横切面取材，10%福尔马林固定，常规脱水包埋，切片4 μm，HE染色。根据肉眼观察和病理组织学检查结果进行综合判断。

结果：在规定的时间内观察，家兔皮肤正常，注射部位正常，未见充血、红肿、变性、坏死等现象。病理检查结果显示，受试药物组兔皮肤结构正常，皮肤内有汗腺、皮脂腺和毛发等，周围组织无坏死和炎性细胞浸润，与空白对照组比较，无明显病理变化。结果见图 1。

图1 皮下组织刺激性试验病理照片（×100）

3 讨论

注射药物安全性评价是药物临床前试验研究的重要组成部分，若有任何一项出现阳性结果，则表明该药物不符合安全性评价标准，不能供临床注射使用。注射用醋酸西曲瑞克目前已在中国上市，鲜有发生过敏反应的报道。在此次体外溶血性试验中，受试药物和参比药物高浓度均出现轻微的红细胞凝聚现象，而低浓度未出现凝聚，凝聚程度和药物浓度呈正相关。鉴于溶血和凝聚反应发生机制较复杂，药物的活性成分及其代谢产物、有关物质、辅料、生产工艺及理化性质（如渗透压、pH等）均有可能引起溶血或凝聚反应的发生，而且凝聚现象的判断受主观因素影响比较大，易出现漏洞。因此，在以后的研究中应采用合理的方法和手段，提高溶血性研究的灵敏性和准确性，以避免假阴性或假阳性试验结果的出现[8－10]。由于目前尚无标准的临床前体内试验方法全面评价药物制剂的溶血反应，因此在长期毒性研究中应该兼顾制剂的溶血性，注意观察溶血反应的有关指标和体征，以综合评价药物的溶血性，并加强临床应用不良反应的监测，进一步考察注射用醋酸西曲瑞克的安全性，保证临床用药安全。

参考文献：

[1]蔡佳利，陈朝晖，耿蓉霞，等.抗癌药西曲瑞克应用研究新进展[J].中国实用医药，2008，3(3)：1－3.

[2]《化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》课题研究组.化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则[Z].北京：国家食品药品监督管理总局，2005.

[3]徐叔云，卞如廉，陈 修.药理实验方法学[M].第3版.北京：人民卫生出版社，2002：203，237.

[4]国家药典委员会.中华人民共和国药典(二部)[M].北京：中国医药科技出版社，2010：附录Ⅺ K，L.

[5]陈 奇.中药药理研究方法学[M].第2版.北京：人民卫生出版社，2006:157.

[6]《中药、天然药物刺激性和溶血性研究的技术指导原则》课题研究组.中药、天然药物刺激性和溶血性研究技术指导原则[Z].北京：国家食品药品监督管理总局，2005.

[7]张广伟，徐晓月 .注射用氨磷汀安全性研究[J].中国药业，2011，20(12):19－21.

[8]张德波，冯 诚，罗 洁，等.乳状液型注射液溶血与凝聚试验探讨[J].中国药品标准，2006，7(5):51－53.

[9]黄应贤，巢 琪.300种中西药注射剂的体外溶血试验[J].中国药学杂志，1985，20(2):77－79.

[10] 雪涛，李 刚，孙振平.对23种中药注射剂溶血与凝聚检查的探讨[J].中国药品标准，2010，11(6):430－432.