参地补肾接骨胶囊薄层鉴别及含量测定研究

韩晓珂，梁朝锋，祁 俊

(芜湖市中医医院，安徽 芜湖 241000)



参地补肾接骨胶囊薄层鉴别及含量测定研究

韩晓珂，梁朝锋，祁 俊

(芜湖市中医医院，安徽 芜湖 241000)

目的：对参地补肾接骨胶囊薄层鉴别和含量测定进行研究。方法：对处方中黄芪、当归、枸杞子进行定性鉴别；采用UV-HPLC法测定何首乌中2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷含量。结果：黄芪、当归、枸杞子斑点清晰，阴性均无干扰，专属性强。2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷在3.08～30.80μg·mL-1范围内线性关系良好(r=0.999 6)，平均回收率为100.2%，RSD为1.83%。结论：该法操作简便、结果准确、重复性好，适用于参地补肾接骨胶囊的质量控制。

参地补肾接骨胶囊；薄层色谱；UV-HPLC；2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷

由于社会进步，交通发达，各种意外导致的骨折患者也逐年增加，在整个治疗过程中，虽然手术效果显著，不过对于轻微的或者是不宜手术的患者以及手术前后的治疗过程中，中药制剂发挥着越来越大的作用。参地补肾接骨胶囊是由生地黄、黄芪、当归、杜仲、枸杞子、丹参、何首乌、骨碎补、续断等二十味中药组成的复方制剂，为芜湖市中医院院内制剂，杜仲[1]主治腰脊痛，具有补肝肾、强筋骨的作用。枸杞子[2]归肝、肾、肺经，凡肝肾不足及肺肾阴虚者，皆可用之。骨碎补[3]具有补肾壮骨、活血止痛的作用，用于骨折、跌打损伤等疾病。自然铜[4]在我国用于接骨疗伤历史悠久，具有接骨续筋、散瘀止痛的作用，治疗筋断骨折、跌打损伤等。它具有骨折愈合所需的多种微量元素。全方药物具有补肾益精血、续骨疗伤作用，用于外伤导致的骨折患者，特别是阴虚阳亢、血分有热等症。为了研究本制剂的质量控制方法，我们对处方中黄芪、当归、枸杞子等药进行了薄层鉴别，对何首乌中的2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷进行了含量测定，建立了简便、有效的质量控制方法。

1 仪器与试药

高效液相色谱仪(Agilent 1200)；梅特勒XP-205电子天平； KQ-500DB型数控超声波清洗仪；2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷(批号：110844-201109，中国食品药品检定研究院)；黄芪甲苷(批号：110781-200613，中国食品药品检定研究院)；当归对照药材(批号：120927-201014，中国食品药品检定研究院)；枸杞子对照药材(批号：121072-201007，中国食品药品检定研究院)；参地补肾接骨胶囊(批号：130501、130504、130507，芜湖市中医医院制剂室)；乙腈 (HPLC/Spectro， TEDIA Company)；水为超纯水(自制)；其它试剂如正丁醇、乙醇、甲醇、三氯甲烷、乙醚、环己烷等均为分析纯。

2 薄层鉴别

2.1 黄芪的薄层鉴别

2.1.1 样品溶液制备 取本品内容物5g，加乙醇30mL，置于锥形瓶中，超声提取30min，滤过，滤液回收浓缩至干，残渣加水50mL使溶解(过程中分少量多次加水)，加正丁醇(水饱和过的)振摇提取3次(50mL、30mL、30mL)，合并正丁醇萃取液，用5%氢氧化钠溶液洗涤2次(30mL/次)，弃去碱液，正丁醇液再用水洗涤2次(30mL/次)，弃去水液，正丁醇液回收浓缩至干，残渣加甲醇1mL使溶解，得样品溶液。

2.1.2 对照品溶液制备 另取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成1mg/mL的溶液，即得对照品溶液。

2.1.3 阴性样品溶液制备 除黄芪药味的其余药材按照原工艺制成缺黄芪制剂，照样品溶液的制备方法制成阴性溶液。吸取上述样品溶液和阴性样品溶液各5μL，对照品溶液2μL，点于同一薄层板(硅胶G)上，展开剂为三氯甲烷-甲醇-水(17∶7∶2)的下层溶液(10℃放置过夜)，展开后晾干，喷以10%硫酸溶液，105℃加热至斑点显色清晰。见图1。

图1 黄芪TLC色谱

2.2 当归的薄层鉴别

2.2.1 样品溶液制备 取本品内容物3g，加乙醚30mL，置于锥形瓶中，超声提取10min，滤过，滤液回收浓缩至干，残渣加乙酸乙酯1mL使溶解，即得供试品溶液。

2.2.2 对照药材溶液制备 另取当归对照药材1g，同法制成对照药材溶液。

2.2.3 阴性样品溶液制备 除当归药味的其余药材按照原工艺制成缺当归制剂，照样品溶液的制备方法制成阴性溶液。吸取上述3种溶液各2μL，分别点于同一薄层板(硅胶G)上，展开剂为环己烷-乙酸乙酯(9∶1)，展开后晾干，置于波长为365nm的紫外灯下检视。见图2。

图1 当归TLC色谱

2.3 枸杞子的薄层鉴别

2.3.1 样品溶液的制备 取本品内容物3g，置于200mL烧杯中，加水35mL，加热煮沸15min(煮沸过程中注意补充水量)，滤过，滤液置分液漏斗中，用乙醚(15mL)振摇提取一次，提取液回收浓缩至1mL，作为样品溶液。

2.3.2 对照药材溶液制备 另取枸杞子对照药材1g，同法制成对照药材溶液。

2.3.3 阴性样品溶液制备 除枸杞子药味的其余药材按照原工艺制成缺枸杞子制剂，照样品溶液的制备方法制成阴性溶液。吸取上述两种溶液各4μL，分别点于同一薄层板(硅胶G)上，展开剂为三氯甲烷-乙醚(2:1)，展开后晾干，置于波长为365nm的紫外灯下检视。见图3。

图3 枸杞子TLC色谱

3 含量测定

3.1 色谱条件

色谱柱：安捷伦(Zorbax SB-C18，4.6mm×250mm，5μm)；流动相：乙腈-水=21∶79；流速：1.0mL/min；检测波长：320nm；柱温：30℃。进样量：10μL。理论塔板数按2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷计算应不低于2 000。

3.2 对照品溶液制备

取2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷对照品适量，精密称定，加稀乙醇制成15μg/mL的溶液，即得。

3.3 供试品溶液制备

取装量差异项下的本品内容物，约1g，精密称定，置100mL具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇25mL，密塞后精密称定重量，超声处理(功率为350W，频率为40kHz)30min，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

3.4 阴性对照溶液制备

除何首乌药味的其余药材按照原工艺制成缺何首乌制剂，按“3.3”项下供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液。

3.5 专属性试验

分别吸取2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10μL，注入Agilent 1200高效液相色谱仪，依法测定，从图4可以看出，阴性对照溶液在2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷保留时间处未出现相应色谱峰，表明本方法专属性好，测定无干扰。见图4。

图4 参地补肾接骨胶囊HPLC色谱

3.6 线性关系考察

取2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷约15mg，精密称定，置于50mL量瓶中，用稀乙醇溶解定容至刻度，摇匀，即得对照品母液(浓度为0.308mg/mL)，精密移取母液5mL，置25mL量瓶中，用稀乙醇稀释定容至刻度，摇匀，即得浓度为61.6μg/mL的对照品溶液。精密吸取浓度为61.6μg/mL的对照品溶液各0.5mL、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL，分别置10mL量瓶中，用稀乙醇稀释并定容至刻度，摇匀，配成浓度为3.08μg/mL、6.16μg/mL、12.32μg/mL、18.48μg/mL、24.64μg/mL、30.80μg/mL的对照品溶液，摇匀后过微孔滤膜(0.45μm)，各取10μL注入Agilent 1200高效液相色谱仪，各平行进样2次，取各个峰面积的平均值作为纵坐标(Y)，进样的浓度作为横坐标(X)，绘制标准曲线。得到2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷的回归方程为Y=29.981X-38.249，r=0.999 6。

3.7 精密度试验

按照“3.1”项色谱条件，取供试品溶液10μL注入HPLC色谱仪，连续进样6次，测得2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷峰面积积分值的RSD为1.91%。

3.7 精密度试验

按照“3.1”项色谱条件，取供试品溶液10μL注入HPLC色谱仪，进样时间分别为0，2，4，6，8，10 h，结果2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷峰面积积分值的RSD为1.47%。该结果说明供试品溶液在10h内是稳定的。

3.9 重复性试验

取相同批号(批号：130501)的样品，按“3.3”项下方法制备供试品溶液6份，按照“3.1”色谱条件，分别进样测定含量。结果供试品中2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷含量的平均值为0.31mg/g，RSD为1.26 %。该结果说明此方法重复性良好。

3.10 加样回收试验

精密称取已测定含量的样品(批号：130501)0.5g，共6份，分别加入2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷适量，按“3.3”项下方法制备供试品溶液，按照“3.1”项下色谱条件，分别进样测定含量，计算加样回收率，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果

结果表明，用本法测定样品中2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷的回收率良好。

3.11 三批样品含量测定

取三批样品各约1g，分别按“3.3”项下方法制备供试品溶液，按照“3.1”项下色谱条件，测定结果并计算含量，结果见表2。

4 讨论

地黄的化学成分有环烯醚萜类、糖类、氨基酸类、挥发油等，其中环烯醚萜类主要是梓醇、二氢梓醇、乙酰梓醇等[5]。但目前一般认为梓醇对热不稳定，无论是干燥或是煎煮过程均会对其含量产生影响，所以在制定质量标准时未考虑测定地黄中梓醇的含量[6]。《本草纲目》记载何首乌“养血益肝、固精益肾、健筋骨”，其[7]含有的卵磷脂和铁，有促进红细胞的生成、补血功能，能全面作用于造血系统，促进骨髓造血及细胞增殖，而2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷是何首乌中特有的生物活性成分，故对何首乌进行了定量分析。

在定量分析过程中，采用不同比例乙腈与水溶液进行洗脱实验研究[8-13]，以分离度及洗脱时间为指标，实验结果表明：乙腈-水(21∶79) 效果最为理想，最终确定乙腈-水(21∶79)为最佳流动相。

表2 三批样品含量测定结果

[1] 彭红梅，李小姝.杜仲的药理研究现状及展望[J].中医学报,2013,28(1)：72-73.

[2] 段文杰.枸杞子的药理作用及价值[J].黑龙江医药,2013,26(6)：127-128.

[3] 张炎兵,田军明.骨碎补的生药研究[J].中医药导报,2013,19(12)：104-105.

[4] 蔡仁诚,王培民.自然铜在中医伤科古籍中的应用及现代研究[J].中国中医急症,2012,21(3)：414-415.

[5] 李建军,李静云,王莹，等.地黄药用研究概述[J].生物学教学,2013,38(3)：4-7.

[6] 张春丽,徐江,李纲，等.不同干燥方法对地黄与玄参中环烯醚萜苷类成分含量的影响[J].解放军药学学报,2010,26(5)：424-426.

[7] 辛淑杰.何首乌的药理作用、临床应用及不良反应[J].北方药学,2013,10(7)：36-37

[8] 国家药典委员会.中国药典(一部)[S].北京:中国医药科技出版社,2010:696

[9] 方燕秋.养肾补血颗粒中二苯乙烯苷的含量测定[J].北方药学,2013,10(3)：12.

[10] 赵炜,朱宽鹏,生书晶，等.何首乌二苯乙烯苷含量差异性研究[J].中华中医药学刊,2014,32(1)：147-149.

[11] 杨慈海,宋军,成森.高效液相色谱法测定颈康胶囊中二苯乙烯苷含量[J].中国药业,2013,22(24)：35-36.

[12] 彭爱华,宋军,成森. 高效液相色谱法测定安神补心片中二苯乙烯苷含量[J].中国药业,2013,22(9)：16-17.

[13] 陈小凯,段启,何伟，等.麒麟丸质量标准的提高研究[J].中国药房,2013,24(23)：2164-2167.

(责任编辑：宋勇刚)

Study on TLC and Quantitative Determination by UV-HPLC for Shendi Bushenjiegu Capsules

Han Xiaoke,Liang Chaofeng , Qi Jun

(Wuhu Hospital of TCM,Anhui 241000,China)

Objective:To study the TLC Identification and Content Determination of Shendi Bushenjiegu Capsules. Methods:Radix astragalus,angelica and lycium barbarum were identified by TLC. The content of 2,3,5,4 '-tetera-hydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside was determined by UV-HPLC. Results:The spots were clear without interference in the blank reference. The response of 2,3,5,4 '-tetera-hydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside was linear in the ranges of 3.08 ～30.80μg·mL-1(r = 0.9996) ,the average recovery was 100.2 % , RSD = 1.83%.Conclusion:The method is simple, accurate,reproducible and can be used for the quality control of Shendi Bushenjiegu Capsules.

Shendi Bushenjiegu Capsules; TLC;UV-HPLC;2,3,5,4 '-tetera-hydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside

2014-08-17

韩晓珂(1981-)，女，安徽省芜湖市中医医院主管中药师，研究方向为中药制剂开发。

R284.1

A

1673-2197(2015)01-0033-03

10.11954/ytctyy.201501016