HPLC法测定冠心Ⅴ号合剂中丹参酮ⅡA含量

夏崇才，周芙琼，顾 宁，高运军，杨炳火

(南京市中医院，江苏 南京 210001)



HPLC法测定冠心Ⅴ号合剂中丹参酮ⅡA含量

夏崇才，周芙琼，顾 宁，高运军，杨炳火*

(南京市中医院，江苏 南京 210001)

目的：建立测定冠心Ⅴ号合剂中丹参酮ⅡA含量的HPLC方法。方法：采用高效液相色谱法，以甲醇-水(80∶20)为流动相，色谱柱为Kromasil C18柱(4.6mm×250mm，5μm)，柱温为30℃，流速为1.0mL·min-1，检测波长为270nm。结果：丹参酮ⅡA在0.012 5～0.360 0μg范围内呈良好的线性关系，平均回收率为98.06%。结论：本方法简便可行、重复性好，可用于测定冠心Ⅴ号合剂中丹参酮ⅡA的含量。

高效液相色谱法；冠心Ⅴ号合剂；丹参酮ⅡA；含量测定

冠心Ⅴ号合剂由丹参、党参、赤芍、麦冬等中药组成，功能益气、养阴生津、安神，用于治疗心悸、心律失常等心血管疾病。

方中丹参是唇型科植物丹参(SalviamiltiorrhizaBge)的干燥根和根茎，始载于《神农本草经》，被列为上品。丹参味苦，性微寒，入心、肝经，具有活血调经、祛瘀止痛、凉血消痈、养血安神、清心除烦的功效，是最常用的活血化瘀中药之一[1-3]。丹参酮(tanshinone，Tsn)是丹参中具有橙黄色和橙红色特征的脂溶性二萜类化合物，按其结构的不同可分为丹参酮I、丹参酮ⅡA、丹参酮ⅡB、隐丹参酮、羟基丹参酮、二氢丹参酮I、异丹参酮、异隐丹参酮、丹参酮甲酯等十多种成分，其中丹参酮ⅡA(Tsn IIA)是丹参中脂溶性成分的代表。

临床上丹参常用于治疗胸痹、冠心病心绞痛、妊娠高血压综合征，用于重症急性胰腺炎(SAP)并发肾功能损害的保护以及肝硬化门脉血流的调节[4-5]。丹参所含脂溶性成分丹参酮ⅡA具有抗心律失常、扩张冠状动脉、保护心肌细胞、保护血管内皮细胞、抗动脉粥样硬化、抗纤维化、抗炎、抗血小板聚集、抗氧化、诱导肿瘤细胞分化和凋亡、改善抗糖尿病微血管并发症等作用[6-7]。

鉴于丹参酮ⅡA的作用，其含量的高低直接影响冠心Ⅴ号合剂的临床疗效。因此，为了控制其质量，本文采用HPLC法对冠心Ⅴ号合剂中丹参酮ⅡA的含量进行测定。该方法简便、准确、重复性好，可有效控制冠心Ⅴ号合剂的质量。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Shimadzu 10Avp高效液相色谱仪(日本岛津公司)；SPD-10Avp型检测器(日本岛津公司)；Du640型紫外分光光度计(Beckman)；KQ-300DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；FA1104电子分析天平(上海良平仪器仪表有限公司)；TS-0.5/20型超声波(清华大学风光仪器厂)；1612-1离心机(上海医疗器械有限公司)。

1.2 试药

冠心Ⅴ号合剂(自制，批号为：20130721、20130725、20130801)；丹参酮ⅡA对照品(中国食品药品检定研究院，批号110766-2007417)；甲醇为色谱纯，水为重蒸水，其它试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Kromasil C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；流速：1.0mL·min-1；检测波长：270nm；柱温：30℃；进样量：10μL；流动相：甲醇-水(80∶20)。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液制备 精密称取丹参酮ⅡA对照品适量，置10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，制成浓度为4.5μg·mL-1的对照品溶液，备用。

2.2.2 供试品溶液制备 称取冠心Ⅴ号合剂1g，精密称定，研匀，置10mL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，密塞，称定重量，超声15min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得供试品溶液，备用。

2.2.3 阴性样品溶液制备 参照制剂工艺过程制备缺丹参的阴性样品，照“2.2.2”项下方法制备缺丹参的阴性样品溶液。

2.3 系统适用性试验

2.3.1 供试品溶液色谱分离 分别取对照品溶液及供试品溶液10μL，注入高效液相色谱仪测试，丹参酮ⅡA的保留时间为13.7min。理论塔板数以丹参酮ⅡA计为1 723，供试品溶液中主峰与其它峰的分离度为1.8(见图1)。

2.3.2 精密度试验 分别精密吸取对照品溶液10μL进样5次，记录色谱峰面积，丹参酮ⅡA的RSD为1.74 %，表明精密度良好。

2.4 线性范围

配制5个不同浓度(1.125、2.25、4.5、9、18、36μg·mL-1)的丹参酮ⅡA对照品溶液，分别取10μL注入色谱仪测定，记录色谱图，测出丹参酮ⅡA峰面积。以丹参酮ⅡA浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得线形回归方程为：A =79 359C +14 141，r=0.999 9。结果表明丹参酮ⅡA在0.012 5～0.360 0μg范围内呈良好线性关系。

2.5 重复性试验

取同一批冠心Ⅴ号合剂溶液，精密称定6份，按拟定的含量测定方法，记录色谱图，量出主峰的峰面积，计算其含量，RSD为1.16 %，表现重复性良好。

2.6 稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液，室温放置，分别于0、2、4、6、8、12h进样，测得丹参素峰面积RSD为0.71 %，结果表明供试品溶液在12h内稳定。

图1 各溶液HPLC图谱

2.7 加样回收率试验

取已知含量的供试品6份，精密称定，分别精密加入一定量的对照品溶液，按“2.2.2”项下方法处理，并按上述色谱条件对丹参酮ⅡA含量进行测定，计算回收率，其平均回收率为98.06 %，RSD为3.49 %。

2.8 样品含量测定

精密称取冠心Ⅴ号合剂1g，照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进行含量测定，按外标法计算3批冠心Ⅴ号合剂中各成分的含量，每批样品配制3份溶液，每份进样2次，结果见表1。

表1 冠心Ⅴ号合剂样品测定结果 (n=3)

3 讨论

3.1 提取溶剂选择

丹参酮ⅡA是方中君药丹参药材的指标性成分，其具有抗血小板聚集、抗急性缺氧等作用，能稳定红细胞膜、抑制血小板功能和抗血栓形成等[8-11]。而丹参酮ⅡA属于脂溶性物质，故选择测定其含量，对控制冠心Ⅴ号合剂的质量具有重要意义。参照《中国药典》(2010年版)，对甲醇、乙醇等提取溶剂进行考察，结果显示，以甲醇为提取溶剂时，有效成分丹参酮ⅡA提取率较高。

3.2 提取方法选择

本实验同时分别采用超声提取、回流提取、索氏提取3种方法进行丹参酮ⅡA的提取，结果显示，采用超声提取15min提取率最高，且超声提取方法操作简便、省时。而回流和索氏提取温度太高、超声时间过长，破坏了有效成分，导致提取率降低。故最终确定以甲醇为提取溶剂，采用超声提取15min。

3.3 流动相选择

，选择甲醇-水为流动相，并对甲醇-水的比例进行考察，结果显示，当以甲醇∶水(80∶20)为流动相时，基线平稳，丹参酮ⅡA峰形较好，分离度大于1.5，理论塔板数大于1 500，出峰时间约为13.7min。故确定以甲醇∶水(80∶20)作为本实验的流动相。

3.4 检测波长选择

取丹参酮ⅡA对照品溶液，在200～400nm范围内扫描，并参考《中国药典》(2010年版)。结果显示丹参酮ⅡA在270nm处有最大吸收，因此确定检测波长为270nm。

丹参酮ⅡA遇光不稳定，实验中丹参酮ⅡA对照品溶液的配制采用棕色容量瓶，供试品溶液应现用现配，并注意低温避光保存。本实验采用HPLC法测定冠心Ⅴ号合剂中丹参酮ⅡA的含量。最佳色谱条件为：色谱柱为Kromasil C18柱(4.6 mm×250mm，5μm)，流动相为甲醇-水(80∶20)，柱温为30℃，流速为1.0mL·min-1，检测波长为270nm。丹参酮ⅡA在0.012 5～0.360 0μg范围内线性关系良好，平均回收率为98.06%，RSD为3.49%。本实验所建立的方法简便、准确、重复性好、回收率高，可用于有效控制冠心Ⅴ号合剂的质量。

参考文献：

[1] 马丙祥,董宠凯.丹参的药理作用研究新进展[J].中国药房,2014,25(7)：663-665.

[2] 王炜辰，吴学辉，郑芳.丹参药理学研究进展[J].海峡药学，2013，25(10)：24-25.

[3] 叶剑.丹参的药用成分与药理作用探析[J].陕西中医学院学报,2012,35(5)：71-73.

[4] 曹金仪.丹参的化学成分及临床用途[J].中国医药指南,2012,10(29)：53-55.

[5] XU Y, FENGD, WANGY, et al. Sodium Tanshinone IIA sulfonate protects mice from ConA - induced hepatitis via inhibiting NF-kappa B and IFN-C/STAT1 pathway [J]. J Clin Immunol, 2008, 28 (5): 512.

[6] 张庆,李晓静.丹参酮ⅡA及其钠盐的药理作用研究进展[J].儿科药学杂志,2012,18(2)：44-46.

[7] 李玉萍，顾兵,刘建涛,等.丹参酮IIA的研究进展[J].时珍国医国药，2010，21(7)：1770-1772.

[8] 张萌涛.丹参酮ⅡA药理作用研究进展[J].医学综述，2010，16(17)：2661-2664.

[9] 袁天荣，赵雪梅.HPLC测定芪参颗粒中丹参酮ⅡA的含量[J].安徽医药，2013，17(11)：1875-1876.

[10] 杨乐,邹晓静,尹钊,等.丹参酮ⅡA磺酸钠对AngⅡ诱导心房成纤维细胞胶原合成及TGF-β1活化的影响[J].中国中药杂志,2014,39(6)：1093-1096.

[11] 王明彦,黄晓飞.宋烨,等. 参茶软胶囊中丹参酮ⅡA和总黄酮的含量测定[J].中国药师,2013,16(12)：1846-1849.

(责任编辑：魏 晓)

Determination of Tanshinone ⅡA in Guanxin Ⅴ Mixture by HPLC

Xia Chongcai，Zhou Fuqiong，Gu Ning，Gao Yunjun，Yang Binghuo*

(Nanjing Hospital of TCM, Nanjing 210001, China)

Objective:To establish an HPLC method for the determination of tanshinone ⅡA in Guanxin Ⅴ Mixture by HPLC. Methods:：HPLC analytical method was established. The analysis was carried out on a column of Kromasil C18(4.6mm×250mm，5μm) with a mobile phase of methanol-water (80∶20) at the flow rate of 1.0 mL·min-1. The column temperature was 30℃. The detection wavelength was 270nm. Results:The linearity range of Tanshinone ⅡA was 0.012 5～0.360 0μg. The average recovery rate was 98.6% and RSD was 3.49%. Conclusion:This method is simple, rapid and accurate, and can be used to determine tanshinone ⅡA in Guanxin Ⅴ Mixture.

HPLC; Guanxin Ⅴ Mixture; Tanshinone ⅡA; Determination

2014-08-19

南京市卫生局科技发展项目(201108005)

夏崇才(1966-)，男，江苏省南京市中医院副主任中药师，研究方向为中药制剂及质量标准。

杨炳火(1966-)，男，江苏省南京市中医院副主任中药师，研究方向为中药制剂及质量标准。

R284.2

A

1673-2197(2015)01-0030-03

10.11954/ytctyy.201501015