基于HepG2、SMMC-7721肝癌细胞生长抑制的鸡血藤总黄酮纯化前后药效对比研究

潘 虹，王 帅，孟宪生* ，包永睿

(1.辽宁中医药大学 药学院，辽宁 大连 116600；2.辽宁省组分中药工程技术研究中心，辽宁 大连 116600；3.辽宁省现代中药研究工程实验室， 辽宁 大连 116600)



基于HepG2、SMMC-7721肝癌细胞生长抑制的鸡血藤总黄酮纯化前后药效对比研究

潘 虹1，2，3，王 帅1，2，3，孟宪生1，2，3*，包永睿1，2，3

(1.辽宁中医药大学 药学院，辽宁 大连 116600；2.辽宁省组分中药工程技术研究中心，辽宁 大连 116600；3.辽宁省现代中药研究工程实验室， 辽宁 大连 116600)

目的：探讨鸡血藤总黄酮纯化前后对HepG2和SMMC-7721肝癌细胞药效对比的影响；明确鸡血藤抗肝癌作用的物质基础。方法：以肝癌细胞抑制率为评价指标，将纯化前后不同剂量的鸡血藤总黄酮分别作用于HepG2和SMMC-7721两株肝癌细胞24h、36h、48h后，采用MTT法检测其对两株肝癌细胞抑制情况。结果：鸡血藤纯化前后的总黄酮均能够显著抑制肝癌HepG2和SMMC-7721肝癌细胞的增殖。相同给药时间内，纯化后的鸡血藤总黄酮对肝癌细胞的抑制率均大于未纯化的鸡血藤黄酮抑制率。此外，无论纯化前与后，其抗肝癌作用随着时间和剂量的增加而增强，呈现显著的时-效、量-效关系(P<0.05)。结论：通过体外药效学比较，显示鸡血藤总黄酮纯化后药效优于纯化前药效，表明鸡血藤总黄酮是鸡血藤抗肝癌的主要物质基础，为鸡血藤在治疗肝癌方面的发展及临床合理利用奠定基础。

鸡血藤总黄酮；肝癌；药效对比；HepG2细胞；SMMC-7721细胞

鸡血藤为豆科植物密花豆(SpatholobussuberectusDunn)的干燥藤茎[1]。 在我国主要分布在广西云南等地，其性温，味苦、甘，归肝、肾经，具有活血补血、调经止痛、舒筋活络之功效。用于月经不调、痛经、经闭、风湿痹痛、麻木瘫痪、血虚萎黄等症[2]。现代研究表明，鸡血藤具有改善血流量、调节免疫、抗炎、抗肿瘤、抗病毒的功效[3]。大量文献报道，鸡血藤总黄酮是其抗肿瘤的主要活性成分[4]。本实验采用MTT法检测鸡血藤黄酮纯化前后作用于HepG2和SMMC-7721两株肝癌细胞的药效，不仅证明了鸡血藤对肝癌具有治疗作用，而且明确了鸡血藤总黄酮是鸡血藤治疗肝癌的物质基础，为鸡血藤的药用价值及在治疗肝癌方面的研究提供理论依据。

1 实验材料

1.1 药材与试剂

鸡血藤药材(购自阳光大药房，产地：河北)；鸡血藤总黄酮(由本实验提取纯化，纯度>80%)；RPMI-1640培养粉、DMEM培养粉、四甲基偶氮唑盐 (MTT)(美国Gibco公司)；小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；青霉素(哈药集团制药总厂，批号： A081100207)；链霉素(大连美罗大药厂，批号：65081216)；水为高压灭菌水。

1.2 仪器

CP225D电子分析天平(德国Sartorius，十万分之一)；MiLLi-Q超纯水处理装置(美国MiLLipore公司)；NUAIRETM US AUTOFLOW型CO2培养箱(德国NUAIRE公司)；AE31型倒置相差显微镜(Motic公司)；HD2-BCN-1360B型生物洁净工作台(哈尔滨东联电子技术开发有限公司)；Sunrise 型酶标仪(奥地利Tecan公司)。

1.3 实验瘤株

人肝癌细胞株HepG2和SMCC-7721，购于上海拜力生物科技有限公司。

2 方法及结果

2.1 细胞培养

人肝癌HepG2细胞株，常规培养于含10%小牛血清的DMEM培养液(内含青霉素、链霉素各100IU·mL-1)中，在 37 ℃、5% CO2培养箱内常规传代培养[5]。

人肝癌SMMC-7721细胞株，常规培养于含10%小牛血清的RPMI-1640培养液(内含青霉素、链霉素各100IU·mL-1)中，在 37 ℃、5% CO2培养箱内常规传代培养[6]。

2.2 鸡血藤纯化前干膏粉末制备

取鸡血藤药材5g，加入30倍量50%乙醇回流提取2次，每次1.5h。将提取液浓缩挥干，减压干燥得鸡血藤纯化前干膏粉末，备用。

2.3 鸡血藤纯化后干膏粉末制备

鸡血藤提取液经过大孔吸附树脂AB-8吸附，上样浓度为0.2g·mL-1，提取液调至pH=3，用6倍柱体积的70%乙醇以1mL·min-1的速度洗脱。通过UV测得总黄酮含量，计算纯度达到80%以上。将洗脱液浓缩挥干，减压干燥得鸡血藤纯化后干膏粉末，备用。

2.4 含药培养液的制备

取鸡血藤纯化前后干膏粉末各10mg分别溶于5mL培养液中，加入2‰DMSO助溶，过0.22μm微孔滤膜滤过，备用。

2.5 MTT 试验

取处于对数生长期的HepG2和SMMC-7721细胞进行计数，调整细胞浓度5×104个/mL，接种于96孔培养板中，设置五个组别，即空白组、加药25μL组、加药50μL组、加药75μL组、加药100μL组，加药后其余体积均用相应的培养液补至200μL。每组设置5个复孔，于37℃，5%CO2及饱和湿度下培养24h、36h、48h。每孔加入20μL MTT(5mg·mL-1)，继续培养4h。加入150μL DMSO孵育10min溶解，于酶标免疫测定仪测定492nm处的吸光度(A)值，计算细胞增殖抑制率[7-9]。

细胞的抑制率=(1-试验组OD/对照组OD)×100%

2.6 结果

2.6.1 鸡血藤总黄酮纯化前不同浓度与不同时间对HepG2细胞吸光度及增殖的影响 鸡血藤总黄酮纯化前后对HepG2细胞吸光度结果见表1、表2。

2.6.2 鸡血藤总黄酮纯化后不同浓度与不同时间对SMMC-7721细胞吸光度及增殖的影响 鸡血藤总黄酮纯化前后对SMMC-7721细胞吸光度结果见表3、表4。

表1 鸡血藤总黄酮纯化前后对HepG2细胞吸光度结果 (±s)

注：每株细胞均与各自对照组比较，*P<0.05。

表2 鸡血藤总黄酮纯化前后对HepG2肝癌细胞株的增长抑制作用结果 (%)

表3 鸡血藤总黄酮纯化前后对SMMC-7721细胞吸光度结果 (±s)

注：每株细胞均与各自对照组比较，*P<0.05。

表4 鸡血藤总黄酮纯化前后对SMMC-7721肝癌细胞株的增长抑制作用结果 (%)

通过MTT法检测结果显示：无论纯化前还是纯化后的鸡血藤总黄酮对HepG2和SMMC-7721两株肝癌细胞均有抑制作用，但抑制程度不同，24h、36h、48h鸡血藤纯化后的黄酮作用于肝癌细胞的抑制率明显大于纯化前。而且从表中可以看出，鸡血藤黄酮纯化前后对肝癌细胞的抑制率均随时间延长和药物剂量增加而逐渐增强，呈现显著的时-效、量-效关系(P<0.05)。

3 讨论

鸡血藤是常用的养血活血药物，中医临床用于治疗肿瘤中晚期病人的血瘀证[10]。然而，近年来关于鸡血藤抗肿瘤的研究，大多针对于肺肿瘤，提示鸡血藤总黄酮对肺癌A549抑制效果较好[11]。本实验针对鸡血藤总黄酮对在治疗肝肿瘤作用方面影响，选取了人肝癌细胞HepG2和SMMC-7721细胞株，发现其对肝癌细胞抑制效果显著，表明了鸡血藤不仅仅可以治疗肺癌，对肝癌也有很好的治疗效果。

从MTT法检测到的细胞抑制率结果看出，未纯化的鸡血藤黄酮作用于两株细胞24h后，抑制率在30%左右，纯化后的鸡血藤黄酮作用于两株细胞24h后，抑制率达到了50%以上；作用时间延长至48h后，纯化前的抑制率达到50%左右，然而纯化之后的抑制率增大到了80%。明显可以看出，纯化后鸡血藤黄酮药效明显优于纯化之前的，且药效显著，这充分说明鸡血藤总黄酮确实是其抗肝癌的物质基础，为鸡血藤治疗肝癌方面的深入研究起到了指导性作用。此外，鸡血藤总黄酮在给药剂量范围内对肝癌细胞的抑制率随时间延长和药物剂量增加而逐渐增强，呈现显著的时-效、量-效关系(P<0.05)，可为临床合理用药提供参考。

近年来肝癌的发病率仍处于世界癌症发病率排行前列，高昂的治疗费用给患者本身、家庭、社会和国家增加了经济负担，因此开发治疗肝癌高效、经济的中草药具有很高的价值和意义。鸡血藤价格低廉，本实验经过体外实验验证鸡血藤确实有抗肝癌细胞的作用，且发挥药效的物质基础已经明确，为抗肝癌新药的研发及鸡血藤的有效利用奠定了坚实基础。

[1] 王宏，刘艺娜，曾祖平，等．鸡血藤抗肿瘤活性部位SSCE指纹图谱的研究[J]．中国中医杂志，2011，36(18)：2525-2528．

[2] 国家药典委员会．中国药典(一部) [S]．北京：中国医药科技出版杜，2010：180．

[3] 符影，程悦，陈建萍，等．鸡血藤化学成分及药理作用研究进展[J]．中草药，2011，42(6)：1229-1233．

[4] 唐勇，何薇，王玉芝，等．鸡血藤黄酮类组分抗肿瘤活性研究[J]．中国实验方剂学杂志，2007，13(2)：51-54．

[5] 费洪新，孙丽慧，张涛，等．人肝癌HepG2细胞培养的体会[J]．卫生职业教育，2007，25(8)：138．

[6] 包永睿，杨欣欣，孟宪生，等．四味肝泰软胶囊对人肝癌细胞株SMCC-7721细胞周期及凋亡影响的初步研究[J]．亚太传统医药，2013，9(1)：8-10．

[7] 魏一萌，王帅，孟宪生，等．基于SMMC-7721肝癌细胞生长抑制的两种败酱草药效比较及提取方法研究[J]．中国医药科学，2013，3(11)：35-37．

[8] 周春权，林静瑜，姚欣，等．藤茶总黄酮体外抗肿瘤实验研究[J]．中国医药科学，2012，2(9)：50-51．

[9] 张云坤，包永睿，孟宪生，等．藏药余甘子抗肿瘤活性成分的提取工艺优化及含量测定[J]．中国医药工业杂志，2012，43(11)：906．

[10] 王笑民．论益气活血法治疗肿瘤[J]．中国中医药信息杂志，1998，5(10)：11-12．

[11] 刘婷，余克花，余燕影，等．丰城鸡血藤H-103树脂提纯物抗MCF-7和A549的作用[J]．实验与检验医学，2008，26(1)：11-20．

(责任编辑：宋勇刚)

Comparative Efficacy before and after Purification of Total Flavonoids in Millettla Based on the Growth Inhibition of HepG2 and SMMC-7721 Hepatic Cell

Pan Hong，Wang Shuai，Meng Xiansheng，Bao Yongrui

(Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Liaoning 116600，China)

Objective:Discussion the pharmacodynamic efficacy before and after purification of total flavonoids in Millettla based on the growth inhibition of HepG2 and SMMC-7721 in liver tumors; Be clear the anti-hepatoma effect of Millettla basis material.Methods:s： Evaluation by Hepatoma cells' Inhibition rate,The total different doses of flavonoids in Millettla before and after purified was given to the two strains of HepG2 and SMMC-7721 hepatoma cells 24h、36h、48h. Detect inhibition of two strains of hepatoma cells by MTT assay. Results:Total flavonoids in Millettla before and after purified were able to inhibit HepG2 and SMMC-7721 cell proliferate significantly. At the same time within the administration,Millettla after purification of total flavonoids inhibit cancer rates greater than unpurified Millettla flavonoids inhibition.In addition,Whether before or after purification,Its anti-liver cancer effects enhanced with the increasing doses and time,Showed a significant time-effect and dose-effect relationship(P<0.05).Conclusion:By the comparison in vitro pharmacodynamic,After purification of total flavonoids Millettla display superior efficacy before purification efficacy,Show Millettla total flavonoids are the main material basis Millettla anti-liver cancer, Lay the foundation for Millettla development in the treatment of liver cancer and the clinical aspects of rational use.

Millettla Total Flavonoids；Hepatic Carcinoma；Efficacy Comparison；HepG2 Cells；SMMC-7721 Cells

2014-08-21

国家“十二五”“重大新药创制”科技重大专项(2013ZX09507005)

潘虹(1989-)，女，辽宁中医药大学硕士研究生，研究方向为药物分析。

孟宪生 (1964-)，男，博士，辽宁中医药大学教授，博士生导师，研究方向为中药组分配伍、代谢组学及药品质量分析。

R285.5;R735.7

A

1673-2197(2015)01-0006-03

10.11954/ytctyy.201501004