杜仲法尼烯基焦磷酸合酶基因cDNA全长的克隆与序列分析

杜次 李菁 彭清 汤鹏 田向荣

摘 要：采用RT-PCR法，从杜仲幼嫩叶片中分离法尼烯基焦磷酸基因cDNA全长序列，克隆并对该基因全长序列进行生物信息学分析。从杜仲嫩叶中共获得两个基因分别命名为EuFPPs1和EuFPPs2，测序结果表明两基因开放阅读框分别为1047bp和1029bp，推测分别可以编码348个和342个氨基酸残基，在线预测表明两个蛋白序列均存在两个聚丙烯合酶位点。系统进化分析结果表明，EuFPPs1和EuFPPs2分别聚集于不同的分支，它们之间的进化距离为0.352，但是在亲缘关系上均与楤木和人参最近，进化距离分别为0.281、0.287，0.175，0.184。关键词：杜仲；FPPs；基因克隆；序列分析：生物信息学中图分类号：Q71

文献标识码：A

文章编号：1007-7847（2015）02-0100-06杜仲是新生代第三纪孑遗植物，是重要的木本药用树种，是我国传统的中药材[1]，现代医药研究表明，杜仲的多种活性成分主要为萜类化合物或萜类相关化合物，如环烯醚萜类的京尼平苷、京尼平苷酸及桃叶珊瑚苷，还有杜仲胶、多糖、氨基酸类、抗真菌蛋白及微量元素等，国内外研究结果表明杜仲有降压、调节血脂、降血糖、增强免疫力等功效[1-6]。 除了其宝贵的药用价值外，杜仲更是重要的天然橡胶资源，具有重要价值的杜仲胶也是萜类化合物，杜仲胶是一种反式聚异戊二烯，为顺式聚异戊二烯的同分异构，但是理化性质具有很大差异，杜仲胶独具塑料二重性，是一种新型的天然高分子功能材料，在国防、橡胶工业、医疗和化工等领域具有非常重要的应用价值[5，6]。因此，研究挖掘萜类生物合成途径相关功能基因对发展杜仲产业具有重要意义。湘西杜仲资源丰富质优，研究湘西地区杜仲胶生物合成途径相关的功能基因，为以细胞工程为手段的杜仲胶工业化生产以及酶工程研究奠定基础。1材料与方法1.试剂与材料

试剂：总RNA提取试剂RNAiso Plus、反转录酶、Taq聚合酶、DNA marker、载体pMD○R 19-T均购自宝生物工程（大连）有限公司（TaKaRa）；克隆宿主菌体大肠杆菌JM109由上海生工提供，引物均由上海生工合成。实验材料：采自本实验室周同的杜仲嫩叶。1.2总RNA提取及cDNA合成剪取杜仲幼嫩枝条，置于装有干冰的泡沫盒中，立即运回实验室提取叶片总RNA。快速称取约100mg杜仲幼嫩叶片，置于液氮预冷的研钵中，倒入少量液氮，迅速研磨成粉，并边研磨边添加液氮。采用TaKaRa公司提供的Trizol试剂，并按试剂所提供的策略经过改良提取总RNA[7]。采用1%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量，并用分光光度汁检测RNA浓度。利用TaKaRa公司的PrimeScript反转录酶试剂盒，试剂盒所提供的方法将所提取的总RNA反转录为第一链互补链DNA（cDNA）。1.3杜仲FPPs基因PCR扩增纯化及克隆

从NCBI上搜索FPPs基因序列，根据对高度相似序列的分析设计特异引物，见表1。以cDNA为模板，并以无菌水为模板做阴性对照，按照以下体系对杜仲FPPs基因进行扩增：10×Ex buffer5.0μL，dNTP（2.5mmol/L each）4.0μL，Primer（F）1.0μL，primer（R）1.0μL，Ex Taq 0.25μL，cDNA4.0μL，补加ddH2O至终体积50.0μL；PCR扩增程序如下：94℃预变性5min；30个循环：94℃变性30s。52℃退火30s，72℃延伸1min；72℃延伸10min，4℃保存。利用TaKaRa公司的Agarose Gel DNA Fragment Recovery Kit Vei.2.0对PCR产物进行割胶纯化，割胶纯化后电泳检测纯化DNA的质量，并用紫外分光光度计检测其浓度。采用TaKaRa公司提供的载体pMD○R19-T，并按其提供的方法将纯化产物连接到载体上，转化由氯化钙法制备的JM 109感受太细胞，在氨苄抗性平板上进行蓝白筛选，挑取菌落经过PCR检测后选择阳性克隆，培养阳性克隆提取质粒送TaKaRa公司测序，测序仪为AB1公司的3730测序仪。1.4杜仲FPPs基因的cDNA序列的信息学分析FPPs基因编码蛋白的理化性质预测采用ExPASy Proteomics Server提供的在线工具Protparam；FPPs基因可表达的蛋白质结构搜索分别采用在线工具ExPASy PROSITE（http：//www.expasy.ch/prosite/）和NCBI在线工具（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi/）。蛋白质二级结构分析和结构域的三维建模采用SWISS-MODEL （http：//swissmodel.espasy.org/）。 采用SignalP4.0 Server （http：//www.cbs，dtu.dk/servers/sigalP/）进行分泌蛋白预测[8]；利用WOLF PSORT（http：//wolfpsort.org/）进行蛋白定位信号预测；采用在线软件HMMTOP（http：//www.enzim.hu/hmmtop/）对蛋白进行跨膜区域预测；通过MEGA5.2构建氨基酸序列系列进化树[9]。2结果与分析2.1杜仲FPPs基因的克隆和序列分析从NCBI数据库中，搜索多个高等植物中FPPs基因的cDNA序列，发现存在两个不同的序列，经过多重比对分析，设计特异引物，以杜仲嫩叶总RNA逆转录所获得的cDNA为模板，利用RT-PCR技术扩增获得的两个基因全长序列扩增产物分别命名为Eu FPPs1、Eu FPPs2（如图1所示），对获得的两个基因扩增产物进行测序，所得序列利用Vectoi，NTI软件分析，发现两个序列均具有完整开放阅读框，长度分别为1047 bp、1029 hp。将序列进行BLAST程序检索，EuFPPs1基因与烟草（Nicotima tabacu.，KJ001141.1）、马铃薯（Solanum tuberosum..XM_006352489.1）、番茄（Solanum， lycopersicum.，XM_004248274.1）、青钱柳（Cyclocarya paliurus.，GU121224.1）、大戟（Euphorbiapekinensis.，FJ755465.1）的相似性分别为75%、75%、75%、74%和72%；EuFPPs2与大丁草（Leibnitzia anandria.，JX424568.1）、芒果（Mangifera indica.，JN035296.1）、蒲公英（Taraxacum mongolicum.，JX424566.1）、紫花苜宿 （Medicago saliva.，CU361537.1）的相似性分别为78%、78%、78%和77%。确定EuFPPs1、EuFPPs2均为杜仲FPPs基因cDNA全长序列，CenBank登录号为KC468-535.1、KC468536.1。2.2EuFPPsl、EuFPPs2基因编码蛋白序列分析EuFPPsl、EuFPPs2基因经在线翻译分别可编码348个和342个氨基酸残基。利用CLUSTRAL X软件对原核生物、藻类和高等植物FPPs行序列比对结果表明，植物FPPS具有与其他生物一样的5个保守结构域[10]，即：结构域I （GKXXR）；结构域II（EXXXXXXLXXDDXXDXXXXRRG）；结构域III（CQXXD）；结构域IV（KT）；结构域IV（GXXFQXXDDXXDXXXXXXXXCKXXX DXXXXK），除原核生物中的结构域IV（KT）不同，其他结构域均具有很高的保守性，如图2，其中富含天冬氨酸的聚丙烯合酶基序[11-15]（LVIDDim..DSshtRRG， MGsyFQVqDDYID），该保守序列在酶的活性催化和底物结合中其重要的功能作用。2.3Eu FPPsl、EuFPPs2基因编码蛋白的理化性质根据ExPASy ProteomICs Server、提供的在线工具Protparam对EuFPPsl、EuFPPs2基因编码的蛋白的理化性质进行预测分析，EuFPPs1、EuFPPs2基因编码的蛋白理化性质如表2。2.4EuFPPsl、EuFPPs2二级结构及三级结构预测

分别对杜仲中的EuFPPs1、EuFPPs2基因编码蛋白的二级结构进行预测，结果表明蛋白EuFPPs1主要由α-螺旋结构构成，占67.7%；β-折叠占7.96%，其他结构占24.340%；EuFPPs2也主要由α-螺旋结构构成，占69.6%；β-折叠占9.28%，其他结构占21.12%。

通过Prosite在线数据库分析EuFPPs1、EuFPPs2蛋白的结构位点，发现EuFPPs1蛋白序列含有5类功能位点，4个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点，2个豆蔻酰化位点，6个蛋白激酶C磷酸化位点，1个氨酰化位点，1个N-端糖基化位点；EuFPPs2蛋白序列含有4类功能位点，分别是1个豆蔻酰化位点，4个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点，3个蛋白激酶C磷酸化位点，1个酪氨酸激酶磷酸化位点。由SWISS-MODEL Workspace在线软件建立的EuFPPsl和EuFPPs2蛋白的三维结构模型，如图3。2.5信号肽及亚细胞定位及跨膜区域预测使用在线软件SignalP4.0 Server对EuFPPs1和EuFPPs2进行预测分析发现，EuFPPs1和EuFPPs2都是非分泌蛋白；WOLFPSORT在线预测表明EuFPPs1最可能定位于细胞质小（cytoplasm：10.0， nucleus： 3.0），EuFPPs2最有可能定位于细胞质中（cytoplasm： 10.0， nucleus： 2.0， mitochondria：1.0）。经过在线软件HMMTOP对EuFPPs1和EuFPPs2基因可编码的蛋白序列进行跨膜预测发现EuFPPs1、FuFPPs2均无跨膜区域。2.6不同物种EuFPPs1、EuFPPs2氨基酸序列比对及进化分析从NCBI的非冗余蛋白数据库（Nr）中选取与EuFPPs1和EuFPPs2基因编码蛋白相似性较高的34条FPPs蛋白序列。采用软件MEGA5.2构建ML系统进化树，如图4所示。高等植物、藻类和原核生物来源的FPPs蛋白序列在进化上分别属于不同的分类群。EuFPPs1和EuFPPs2分别聚集于不同的分支，但是在亲缘关系上均与楤木和人参最近，其中EuFPPs1与楤木和人参的进化距离分别为0.281和0.287，EuFPPs2与楤木和人参分别为0.175和0.184。3 讨论

法尼烯基焦磷酸合酶（ FPPs）是异戊二烯途径中的重要调节酶，在植物体内催化异戊烯基焦磷酸和牻牛儿基焦磷酸生成法尼烯基焦磷酸（FPP），是各种倍半萜化合物如脱落酸和杜松烯等的合成前体[16、17]。法尼烯基焦磷酸可经过牻叶儿基牻牛儿基焦磷酸合酶（GGPPs）合成聚异戊二烯的前体牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸（GGPP），同时FPP也可直接作为前体生成聚异戊二烯。因此，FPPs在植物多种生物活性物质，尤其是橡胶胶等重要的工业原料的合成中具有重要的作用。

生物信息学分析是预测基因功能的有效手段[18]。到目前为止，植物FPPS基因已分别从橡胶[19]、烟草[20]、高粱[21]、水稻[22]、刺五加[23]、丹参等40多种植物中分离克隆出来，经过测序分析，植物FPPSmRNA长度范围为1040～1731bp，外放阅读框长度范同为924～1224 bp，可编码由307～407个氨基酸组成的多肽。

成功克隆了杜仲中的两个法尼烯基焦磷酸合成酶基因（EuFPPs1和EuFPPs2），并对其全长cDNA序列进行测序和生物信息学分析，推测杜仲EuFPPsl和EuFPPs2基因分别可编码348个和342个氨基酸残基，相对分子质量为40.04kD和39.55kD，与已研究报道的大多数FPPs大小相同或相近。WOLFPSORT预测结果表明EuFPPs1和EuFPPs2最可能定位在细胞质中，均含有两个聚丙烯合酶基序。FPP合成酶是一种细胞质二聚酶，而且无论原核生物还是真核生物，其FPPs均含有聚丙烯合酶基序，具有高度的保守性，在植物萜类化合物的生物合成中发挥重要的功能[9-13]。因此，本研究从杜仲中克隆的两个EuFPPs均属于FPPs基因家族，在杜仲的萜类化合物及杜仲胶的合成中发挥重要作用。

EuFPPsl和EuFPPs2相差6个氨基酸残基，它们之间的相似性为72.4%，系统发育分析表明EuFPPs1与EuFPPs2聚集在同一类群不同分支，两者间的进化距离为0.352，而且在亲缘关系上均与楤木和人参最近，其进化距离分为0.281、0.287；0.175、0.184。据杜仲EuFPPs1和EuFPPs2间的序列差异，推测两者可能存在功能上的差异，可能分别调控不同的分支代谢途径，因此，EuFPPs1和EuFPPs2在杜仲中的代谢差异和分子机制有待进一步的研究。[1]杜红岩.杜仲活性成分与药理研究的新进展[J].经济林研究 （DU Hong-yan. The progress in research of the active compo?nent from Eucommia ulmoides and its Pharmacologyf[J]. Economic Forest Researches），2003，21（2）： 58-61.[2]KWAN C Y， CHEN C X， DEYAMA T， el d. Endothel iumdependent vasorelaxant effects of the aqueous extracts of the Eucommia ulmoides Oliv. Leaf and bark： implication on their antihyperlensive action[J]. Vascular Pharmacol，2004，11（24）：229-235.[3] LEE G W， YON H C， BYUN S Y. Inhibitory effect of Eucommia ulmoides Oliver on adipogenic differentiation through promeanalysis[J]. Enzyme and Microbial Technology，2004，（6）： 52-638.[4]OK AD A N， SHIATA K， NIWANO M， et al. Immunosuppressive activity of a monoterpene from Eucommia ulmoides[J]. Phytochemistry，1994，37（1）：281-282.[5]TANGPAKDEE J， TANAKA Y， SHIBA K， et al. Structure and biosynthesis of trans-polyisoprene from Eucommia ulmoides[J]. Phytochemistry，1997，45（1）：75-80.[6]艾伦强，李婷婷，何银生，等.杜仲的应用研究进展[J].亚太传统医药（Al Lun -qiang， LI Ting -ting， HE Yin -sheng， et al. Progress in Research on Application of Eucommiae Ulmoides[J]. Asia-Pacific Traditional Medicine），2010，6（10）：163-165.[7]周明兵，王红珍，赵德刚.杜仲叶和树皮总RNA的快速提取法[J].山地农业生物学报（ZHOU Ming-bing， WANG Hong-zhen， ZHAO De -gang. Fast extraction of RNA in barks and leaves of Eucommia amloides Olive[J]. Journal of Mountain Agriculture and Biology），2003， 22（5）：430-431.[8]HENRIK N， JACOB E， S0REN B， et al. Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites[J]. Protein Engineering Design&Selection，1997，10（1）：1-6.[9]TAMURAK， PETERSON D， PETERSON N， et al. MEGA 5： Molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood， evolutionary distance，and maximum parsimony methods[J]. Molecular Biology and Evolution，2011，28（10）：2731-2739.[10]WANG P， LIAO Z， GUO L. Cloning and functional analysis of a cDN A encoding Ginkgo biloba farnesyl diphosphate synthase[J]. Molecules and Cells，2004，18（2）：150-156.[11]ASHBY M N， EDWARDS P A. Elucidation of the deficiency in two yeast coenzyme Q mutants. Characterization of the structural gene encoding hexaprenyl pyrophosphate synthase[J].Journal of Biological Chemistry， 1990，265（22）：13157-13164.[12]FUJISAKI S， HARA H， NISHIMURA Y， et al. Cloning and nucleotide sequence of the ispA gene responsible for farnesyl diphosphate synthase activity in Escherichia coli[J] Journal of Biochemistry，1990，108（6）：995-1000.[13]CARATT0L1 A， ROMANO N， BALLARIO P， et al. The Neurospora crassa carotenoid biosynthetic gene （albino 3） reveals highly conserved regions among prenyltransferases[J]. Journal of Hiological Chemistry，1991，266（9）：5854-5859.[14]KUNTZ M， KOMER S， SUIRE C， et al. Identification of a cDNA for the plastidlocated geranylgeranyl pyrophosphate synthase from Capsicum arinuum： correlative increase in enzyme activity and transcript level during fruitripening[J].Plant Journal，1992，2（1）：25-34.[15]MATH S K， HEARST J E， POULTER C D， et al. The crtE gene in Erwinia herbicola encodes geranylgeranyl diphosphate synthase[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1992，89（15）：6761-6764.[16]陈新，李玲玲，吕慧贞，等.法呢基焦磷酸（FPP）的生物合成 及其分子调控[J].生物技术通报（CHEN Xin， LI Ling-ling， LU Hui—zhen， et al. The biosynthetic pathway and molecular regulation of Farnesyl Diphosphate （FPP）[J]. Biotechnology Bulletin）， 2007，（2）：67-71.[17]李永波，樊庆琦，王宝莲，等.植物法呢基焦磷酸合酶基因 （FPPS）研究进展[J].农业生物技术学报（LI Yong-bo， FAN Qing-qi， WANG Bao-lian， et al. Advances in the study of plant farnesyl pyrophosphate synthase genes （FPPS）[J]. Journal of Agricultural Biotechnology），2012，20（3）：321—330.[18]SUN Y Z， NIU Y Y， LI Y， et al. Cloning and bioinformatics analysis of PqERFX gene in Panax q uinq uefolius [J]. Acta Pharmacologica Sinica，2011，46（8）： 1008-1014.[19]郭冬，李辉亮，彭世清.巴西橡胶树法尼基焦磷酸合酶基因 5'调控序列的克隆及功能初步鉴定[J].热带农业工程学报（GUO Dong， LI Hui -liang，PENG Shi-qing.Cloning and function analysis of 5' regulatory region for HbFPS from Hevea brasilien-Tropical Agricultural Engineering）， 2010， 34（6）： 31-36.[20]段娜娜，岳彩鹏，苗红梅，等.烟草法呢基焦磷酸合酶基因的 克隆及序列分析[J].烟草农学（DUAN Na-na， YUE Cai-peng， MIAO Hong-mei， et al. Molecular cloning and sequence analysis of farnesyl prophosphate synthase gene in tobacco[J]. Tobacco Agronomy）， 2010，（1）：56-59.[21]PATERSON A H， BOWERS J E， BRUGGMANN R， et al. The sorghum bicolor genome and the diversification of grasses [J]. Nature， 2009， 457（7229）： 551-556.[22]SANMIYA K， IWASAKI T， MATSUOKA M， et al. Cloning of a cDNA that encodes farnesyl diphosphate synthase and the blue-light-induced expression of the corresponding gene in the leaves of rice plants[J]. Biochimica et Riophysica Acta， 1997， 1350 （3）： 240-246.[23]周秘，柴丽花，修乐山，等.刺五加法呢基焦磷酸合酶基因的表达及其与皂苷含量的相关性分析[J].河南农业科学（ZHOlf Mi， CHAI Li -hua， XIU Le -shan， et al. Expression level of Eleutherococcus senticosus farnesyl diphosphate synthase gene and its correlation with Saponin contenfj]. Journal of Henan A-gricultural Sciences），2013， 42（12）：106-109.[24]周露，化文平，杨滢，等.丹参法呢基焦磷酸合酶基因（SmF- PPsl）的表达模式[J].陕西师范大学学报（ZHOU Lu， HUA Wen-ping， YANG Ying， et al. Expression pattern of farnesyl diphosphate synthase （SmFPPS 1） from Salvia Miltiorrhiza Bunge[J]. Journal of Shaanxi Normal University （Natural Science Edition）），2013，41（2）：70-75.