海马等8种海洋中药体外抗氧化活性的比较

林芳花等

摘要[目的]比较研究海马等8种海洋中药体外抗氧化活性。[方法]测定高锰酸钾还原所需的氧化时间；采用光照核黄素产生超氧阴离子，并测定清除率；采用普鲁士蓝法测定总还原力。[结果] 氧化时间从短到长顺序：海马<海龙<海藻<龟甲胶<海螵蛸<龟甲<牡蛎<瓦楞子，其中海马氧化时间21.2 s，与Vc相比无显著差异（P>0.05）。超氧阴离子清除率大小顺序：海螵蛸>龟甲胶>海龙>海马>海藻>龟甲>牡蛎>瓦楞子，其中海螵蛸清除率42.21%，与Vc相比无显著差异（P>0.05）。总还原力强弱顺序：龟甲胶>海龙>海马>海藻>牡蛎>海螵蛸>龟甲>瓦楞子。[结论]海马、海龙、海螵蛸、海藻、龟甲和龟甲胶的抗氧化活性较高，但效果均不及Vc，瓦楞子、牡蛎抗氧化活性较低，龟甲胶抗氧化活性高于龟甲。

关键词海马；海洋药物；抗氧化活性

中图分类号S986.2文献标识码A文章编号0517-6611（2015）29-073-02

海洋中药是指在中医药理论指导下用于防病治病和养生保健的物质，其来源包括生活于海水、海底泥滩或岩石、浅海沙滩的动物、植物及海洋中的矿物，也包括生活于海洋周围的、以海洋生物为食的鸟类。《中药大辞典》记载海洋中药共134种，海洋中药的研究、开发与应用滞后于陆地来源中药。海洋生物生存环境特殊，具有陆地生物所没有的化学成分，种类繁多、资源丰富，可再生性强，发展潜力巨大，近年来其研究热点集中在海洋活性产物的研究与开发、海洋微生物的研究与开发、海洋生物基因工程技术等方面。健康长寿是人类幸福的永恒主题，而抗氧化延缓衰老是现代生物科学研究领域热点之一[2-4]，目前有关海洋中药抗氧化活性的研究报道较少。基于此，笔者研究并比较了8种常用海洋中药的体外抗氧化活性，以初步评价其活性。

1材料与方法

1.1药材

海马等8种中药于2014年10月购自广东省惠州市惠城区北京同仁堂药店，经惠州学院生命科学系林芳花副教授检定，符合2010年版《中国药典》质量要求，粉碎，过4号筛，备用。

1.2仪器

FA1104N电子天平（上海精天电子仪器有限公司，精度0.1 mg）、PH050型电热恒温干燥箱（上海实验仪器厂）、HH4数显恒温水浴锅（常州澳华仪器有限公司）、KH3200DB型数控超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）、HSX250恒温恒湿箱（上海申贤恒温设备厂）、UV2450紫外-可见分光光度计（日本岛津公司）、SPX300BG型光照培养箱（上海博讯实业有限公司）。

1.3试药

维生素C（Vc）、无水乙醇、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氮蓝四唑（NBT）、核黄素、蛋氨酸、三氯乙酸、氯化铁、铁氰化钾、高锰酸钾、浓硫酸、盐酸等均为分析纯。

1.4试验方法

1.4.1对照品溶液的制备。

取Vc 0.05 g，精密称定后置于50 ml量瓶中，加水至刻度，使其溶解并摇匀，备用。

1.4.2样品溶液的制备。

取药材粉末各5 g，精密称定后置于100 ml锥形瓶中，加入50%乙醇50 ml，静置30 min，超声处理（功率500 W，频率40 kHz，50 ℃）30 min，过滤后将滤液置于50 ml量瓶中，加水至刻度后摇匀，备用。

1.4.3氧化时间的测定。

参照2010年版《中国药典》方法并经适当改进，测定氧化时间。精密量取续滤液10 ml，置于具塞锥形瓶中，立即加入20%硫酸溶液2 ml，振荡1 min，立即加入0.02 mol/L高锰酸钾溶液0.05 ml，开始计时，直至溶液中紫红色完全消退时停止。

1.4.4超氧阴离子清除率的测定。

参照文献[6]的方法并适当改进，测定超氧阴离子清除率。以0.105 mol/L pH 74的PBS缓冲液为溶剂，配制1.67×10-5 mol/L核黄素，0.01 mol/L蛋氨酸，9.2×10-5 mol/L NBT。分别吸取上述3种溶液各2 ml，加入样品溶液1.0 ml，置于光照培养箱中光照30 min，以缓冲液为对照，于波长560 nm处测定吸光度，按照以下公式计算超氧阴离子清除率：

超氧阴离子清除率（%）=（A0-A样）/ A0×100%（1）

式中，A0为对照溶液的吸光度，A样为样品溶液的吸光度。

1.4.5总还原力的测定。

参照文献[6]的方法并经适当改进，测定总还原力。取样品溶液0.1 ml，加入0.2 mol/L pH 6.6磷酸盐缓冲液2.5 ml，加入1%铁氰化钾K3[Fe（CN）6]溶液5.0 ml，置于50 ℃水浴中反应20 min，迅速冷却，加入10%三氯乙酸溶液2.5 ml，混匀，3 000 r/min离心10 min。取上清液2.5 ml，加入水2.5 ml，加入0.1%的氯化铁溶液0.5 ml并混匀，室温下放置10 min，于波長700 nm处测定吸光度。

1.4.6数据统计与分析。

试验数据以平均值±标准差（±s）表示，多组间样本均数的比较采用方差分析，试验数据使用SPSS 10.0统计软件进行统计与分析。

2结果与分析

2.1氧化时间

高锰酸钾发生还原反应，Mn7+变为Mn2+，溶液由紫红色变为无色，褪色时间越短，表明待测样品抗氧化活性越强。由表1可知，氧化时间顺序为海马<海龙<海藻<龟甲胶<海螵蛸<龟甲<牡蛎<瓦楞子，其中海马所需时间最短，与Vc相比无显著差异（P>0.05），海龙、海藻和龟甲胶的氧化时间较短，但与Vc相比差异显著（P<0.05），海螵蛸、龟甲、牡蛎和瓦楞子的氧化时间较长，与Vc相比差异极显著（P<0.01）。

2.2超氧阴离子清除率

超氧阴离子将NBT还原为蓝紫色物质，在波长560 nm处有最大吸收峰，采用光照核黄素的方法产生超氧阴离子，在抗氧化剂作用下超氧阴离子因为发生歧化反应而减少，对NBT的还原作用减弱，测定吸光度，计算清除率，可以间接反映待测样品的抗氧化活性。由表1可知，超氧阴离子清除率大小顺序为海螵蛸>龟甲胶>海龙>海马>海藻>龟甲>牡蛎>瓦楞子，其中海螵蛸清除能力最强，与Vc相比无显著差异（P>0.05），龟甲胶、海龙、海马、海藻、龟甲的清除能力较强，但与Vc相比有显著差异（P<005），牡蛎和瓦楞子的清除能力较弱，与Vc相比差异极显著（P<0.01）。

2.3总还原力

铁氰化钾还原成亚铁氰化钾，与Fe3+反应生成普鲁士蓝，在波长700 nm处有最大吸收峰，吸光度越大表示待测样品的还原力越强，即抗氧化活性越高。总还原力强弱顺序为龟甲胶>海龍>海马>海藻>牡蛎>海螵蛸>龟甲>瓦楞子，8种样品总还原力均弱于Vc。

3讨论

笔者通过测定氧化时间、超氧阴离子清除率和总还原力，对比海马等8种常用海洋中药的体外抗氧化活性，用不同作用机制来评价其抗氧化活性。结果表明，海马、海龙、海螵蛸、海藻、龟甲、龟甲胶的氧化时间较短，超氧阴离子清除率较高，总还原力也较强，表明其抗氧化活性较高，但总体上均弱于Vc，而瓦楞子和牡蛎的抗氧化活性较低。

谢学明等研究了龟甲石油醚、乙酸乙酯和乙醇提取部位的体外抗氧化活性，结果发现乙醇部位的抗氧化活性最高。黄春花等发现海南产龟板的抗氧化活性高于湖北汉阳产龟板，但未明确龟甲抗氧化活性成分，而龟甲胶的抗氧化活性研究尚未见报道。该试验中龟甲和龟甲胶在氧化时间、超氧阴离子清除率、总还原力3个评价指标都表现出较高的抗氧化活性，且龟甲胶的抗氧化活性高于龟甲，分析其原因可能是龟甲胶经煎煮、浓缩后，单位重量中所含抗氧化活性成分多于龟甲，由于试验条件和时间所限，笔者未对龟甲和龟甲胶的抗氧化活性成分进行深入研究。

参考文献

[1] 文艳.海洋药物研发现状及未来发展趋势分析[J].中国渔业经济，2006（3）：43-49.

[2] RODRIGUES E，MARIUTTI L R B，MERCADANTE A Z.Scavenging capacity of marine carotenoids against oxygen and nitrogen species in a membrane-mimicking system[J].Marine drugs，2012，10（8）：1784-1798.

[3] GONZLEZ P M，MALANGA G，PUNTARULO S.Cellular Oxidant/Antioxidant network： update on the environmental effects over marine organisms[J].The open marine biology，2015，9（1）：1-13.

[4] ALAM M N，BRISTI N J，RAFIQUZZAMAN M.Review on in vivo and in vitro methods evaluation of antioxidant activity [J].Saudi pharmaceutical，2013，21（2）：143-152.

[5] 中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国药典：第一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：336-337.

[6] 林芳花，彭永宏，张启斌，等.荔枝不同部位的体外抗氧化活性实验研究[J].中国食品卫生杂志，2011，23（4）：310-313.

[7] 谢学明，李熙灿，钟远声，等.龟板体外抗氧化活性的研究[J].中国药房，2006，17（18）：1368-1370.

[8] 黄春花，李熙灿，陈东风.两种不同产地龟甲抗氧化活性研究[J].现代预防医学，2007，34（5）：820-830.

[9] 杜沛霖，周雨晴，朱华.龟甲的研究进展[J].安徽农业科学，2014，42（3）：11319-11320，11338.