雏鸡沙门氏菌病的生化鉴定与综合防治

李亚妮 李培峰

摘  要：采集平定县某自然发病鸡场15只病死雏鸡病料，经细菌分离培养、病理组织学观察、生化试验、平板凝集试验，确诊为鸡白痢沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌两种血清型混合感染所致。利用纸片法药敏试验，结果显示6株沙门氏菌的高敏药物有6种，分别是头孢呋肟、氧氟沙星、诺氟沙星、庆大霉素、卡那霉素、四环素。使用头孢呋肟对群体进行治疗，鸡群病情明显改善。

关键词：沙门氏菌;生化鉴定; 药敏试验;综合防治

中图分类号：S858.314.4+3     文献标识码：B     文章编号：1673-1085（2015）03-0009-05

鸡沙门氏菌是由沙门氏菌属中一个或多个成员所引起的鸡急性或慢性传染病[1]，引起禽类发病的沙门氏菌主要有鸡白痢沙菌、鸡伤寒沙门氏菌及有鞭毛能运动的多种副伤寒沙门氏菌[2]，一直是危害养鸡生产的最严重的细菌性传染病之一，沙门氏菌具有致病性强、垂直传播等特点，而且由于抗菌药物的滥用，沙门氏菌的耐药谱也越来越广，一旦感染，防治困难较大，可给种鸡及蛋鸡生产带来极大损失[2，3]。目前我国一些规模较大的种禽场对鸡白痢已经实施了比较严格的净化措施，但仍有相当一部分鸡饲养者为小规模养殖，缺乏鸡白痢的净化意识，舍不得投入，该病的危害仍然比较严重。陈自望等1999、2003、2004年对福州市部分父母代种鸡场进行了鸡白痢杆菌病的血清学调查，结果发现这3年的平均阳性率分别为18.8%、30.7%、70.9%，阳性率逐年呈上升趋势，且阳性率很高[4]。

鸡沙门氏菌病的发生与传播的主要阶段是在育雏的早期。因此，必须重视育雏期的环境控制，进行合理消毒，防止水平传播的发生。吴斌等[5]从进口的213份样品中，共发现了13株沙门氏菌，其中鱼粉中占4.69%（3/64），肉骨粉中占9.43%（10/106）。可见，饲料中的沙门氏菌也直接威胁着饲用鸡只的健康。

为了减轻由此造成的死亡和损失，许多鸡场都积极地用药物进行本病的防治。焦新安等对我国部分地区1962～1999年间346株鸡白痢沙门氏菌进行了药物敏感性测定，结果表明，在近40年时间里，鸡白痢沙门氏菌对氨苄青霉素、壮观霉素、复方磺胺、磺胺异恶性唑、甲氧苄胺嘧啶、羧苄青霉素、四环素、链霉素、青霉素的耐药率显著增强，菌株的多重耐药率明显增加[6]。为提高疗效，研究表明用药敏试验的方法确定敏感药物后再组方进行治疗，疗效显著。

近年来山西地区发生的雏鸡感染沙门氏菌损失严重，广大养殖户缺乏必要的诊断手段，影响了治疗进程。我们旨在通过实验室手段，进一步明晰该病的病原情况，采取有效的用药措施，既解决了广大养殖户的燃眉之急，也完善该病的综合防治措施理论，从而达到减低发病或达到净化效果，促进养鸡业的持续健康发展。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  被检材料  15只病死雏鸡均取自平定某自然发病鸡场。

1.1.2  培养基  普通营养琼脂、营养肉汤、麦康凯琼脂、S.S.琼脂、鲜血琼脂培养基（购于杭州天和生物制品有限公司）。

1.1.3  主要试剂  沙门氏菌属诊断血清（购于杭州天和生物制品有限公司）、微量糖发酵管及抗生素药敏纸片（购于杭州天和生物制品有限公司）。

1.1.4  试验动物  由平定县某种鸡场提供5日龄雏鸡共120只。

1.2  方法

1.2.1  细菌形态及运动力观察  病料直接涂片后染色镜检;选取可疑菌落涂片染色、镜检。并对不同菌株进行悬滴运动力检查[7]，全部25块病料涂片检查，用革兰氏染色法染色后镜检。

1.2.2  分离培养[8]  无菌取肝脾组织，接种于营养肉汤、普通营养琼脂、血液琼脂、麦康凯琼脂和S.S.琼脂培养基上，置37℃恒温培养箱培养24h，观察细菌生长情况及菌落特征。将细菌纯培养物接种三糖铁（TSI）琼脂，37℃培养24h。

1.2.3  病理组织学观察  取具有眼观病变的肝、脾、肾、心脏、卵巢及肿瘤组织，10%福尔马林溶液固定，石蜡包埋切片，H.E染色，病理组织学检查。

1.2.4  动物回归试验  用分离到的纯化的病菌按107～1010稀释后采用营养琼脂平板散布法做活菌计数计算每毫升的平均活菌量，把细菌用生理盐水稀释成10×109cfu/ml的悬液。取60只饲养到5日龄的肉雏鸡分为两组，每组30只，试验组肉雏鸡口服菌液2ml/只，对照组肉雏鸡口服生理盐水2ml/只。分开饲养观察发病和死亡症状，连续观察7d记录结果，取死亡鸡只无菌采集心、肝、肺划线接种于S·S琼脂平板上，37℃恒温培养18～24h，取典型的红色菌落接种于营养琼脂试管斜面上，37℃恒温培养18～24h做好标记，放4℃冰箱保存备用，再取60只5日龄的肉雏鸡重复以上试验，对比两次试验的结果。

1.2.5  生化试验  取已分离纯化的菌株和两次动物回归试验的菌株用VITEX32全自动生化分析仪进行分析鉴定。

1.2.6  平板凝集试验  取这三种菌液各50μl与等量的鸡沙门氏菌多价阳性血清做平板凝集试验，呈现颗粒凝集的为阳性反应。随机抽检100只晋中某自然发病种鸡场的种鸡，采集血清用标准鸡沙门氏菌抗原进行平板凝集试验，呈现颗粒凝集的为阳性反应。计算其阳性率。

1.2.7  药物敏感性试验  采用纸片扩散法将纯培养分离出的6株沙门氏菌菌液，用灭菌的接种环均匀致密划线于营养琼脂平板培养基表面。用无菌镊子夹取药物纸片（杭州微生物试剂有限公司）贴在已接种的琼脂平板培养基上，纸片要贴均匀，纸片与纸片中心距离不得小于24mm，每个平板上贴5张。纸片贴后不应再移动，因为有些药物会立即扩散。贴上纸片15min内把平板倒置放入保温箱37℃下培养16～24h，检查药物纸片。

用游标卡尺测量其抑菌圈环直径，根据药敏试验抑菌圈环直径判断标准来判断细菌对药物的敏感性。判定标准为：抑菌圈直径≥15mm的为高敏， 10～15mm的为敏感，<10mm的为耐药。

2  结果与分析

2.1  形态特征和运动力  病料直接涂片，革兰氏染色之后，油镜下观察，可发现少量革兰氏阴性直杆菌;挑取S·S琼脂平板上的单个菌落，涂片、火焰固定、革兰氏染色、镜检可见红色、着色均一、单个或成对的两端浑圆的小直杆菌，无荚膜，无芽孢。符合鸡沙门氏菌特征。

2.2  培养特性  分离菌在普通营养琼脂上呈圆形、微隆起、光滑、湿润、半透明或灰白色、边缘整齐，直径小于1mm的针尖大小“露珠状”小菌落;在麦康凯琼脂上长出无色透明，直径有1mm的圆形小菌落;在鲜血琼脂上不溶血;在S.S琼脂上形成中心黑色、边缘灰白的透明小菌落;营养肉汤培养物呈均匀混浊，管底有少量沉淀物。三糖铁斜面划线培养，斜面上为红色，底层穿刺培养，底层多数产生H2S为黑色，少数为黄色。

2.3  病理组织学观查  从镜检肝组织内见许多坏死灶，坏死灶内充满淋巴细胞、少量巨噬细胞和异嗜性白细胞，肠系膜见以淋巴细胞浸润、结缔组织增生为主肉芽肿病变，肾间质淋巴细胞浸润、结缔组织增生，胰腺细胞坏死，偶有肉芽肿病变，见图1、图2、图3。

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2.4  动物回归试验  结果见表1。

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两次动物回归试验，试验组鸡只发病症状及剖检症状相似，同肉种鸡场的病、死鸡外表状态及剖检症状均一致，两组分离的病原菌在S·S琼脂平板上长出细小、红色、光滑湿润、圆形半透明大小为1mm的菌落。挑取S·S琼脂平板上的单个菌落，涂片、革兰氏染色、镜检，两组分离的病原菌同接种的病原菌形态，大小相似。动物回归试验结果与实际发病情况相一致。两组试验的生理盐水对照组均生长良好，没有发病鸡只。

2.5  生化试验  结果见表2。

将供试的22个菌株经纯培养后分别接种于下列发酵管中观察结果如表1。

因多数鸡白痢沙门氏菌不发酵麦芽糖和卫矛醇。可确认S1～S14菌株属于沙门氏菌属D群中的鸡白痢沙门氏菌;S15～S22菌株属于沙门氏菌属D群中的鸡伤寒沙门氏菌[9]。

2.6平板凝集试验结果  三株细菌与标准鸡沙门氏菌多价阳性血清均发生颗粒凝集反应，平板凝集试验为阳性，证明这三株细菌为鸡沙门氏菌。

种鸡平板凝集试验阳性率为15%，证明本种鸡场鸡沙门氏菌未净化干净。

2.7  药物敏感性试验  从药敏试验结果的整体看，所选的6株分离菌对供试的8种抗菌药物的敏感性相似;同一血清型内不同菌株的药敏性表现基本一致，见表3。

由表3可知，6株沙门氏菌的高敏药物有6种，分别是头孢呋肟、氧氟沙星、诺氟沙星、庆大霉素、卡那霉素、四环素，它们都可以作为临床上有效的治疗药物。值得注意的是，随着药物在鸡场使用年限的增加，沙门氏菌的耐药程度也逐渐加强，而且出现多重耐药的现象，这与相关报道是一致的[10]。因此对此病治疗前应做药敏试验。

3  综合防治

3.1  根据药敏试验结果用头孢呋肟按治疗量的1.5倍饮水治疗，同时水中加肾肿解毒药及速溶性多种维生素。病鸡第二天开始病情明显改善，死亡鸡只每天减少，到第7天鸡只基本正常，没有死亡鸡只。

3.2  搞好饲养场的环境卫生消毒，发病期间用1%的苯酚每日消毒一次，连续5d，以后隔日一次。

3.3  控制雏鸡的饲养密度和鸡舍的保温，同时要保障通风换气，提高饲养环境质量。

3.4  做好各种疫病的预防和控制，用0.5%的过氧乙酸带鸡消毒，每3d进行一次喷雾消毒，按照防疫程序及时接种疫苗。

4  小结与讨论

4.1  本病的传染源主要为病鸡和带菌鸡。传播途径有水平传播和垂直传播，本鸡场雏鸡沙门氏菌病的这次爆发与种母鸡的鸡沙门氏菌病有很重要的关联，本种鸡场鸡沙门氏菌病的阳性检出率为15%。带菌公鸡可通过精液将病原传给母鸡，母鸡又可通过垂直传播污染种蛋，所以雏鸡就感染了鸡沙门氏菌病，造成了很大的经济损失，因此对种鸡的鸡沙门氏菌净化和对种蛋彻底进行消毒，是控制该病发生的重要措施，对预防雏鸡沙门氏菌尤为重要，雏鸡用敏感药物预防对本病有很好的控制作用。种鸡鸡沙门氏菌净化：开产前一次，产蛋高峰一次，350日龄再检一次，可采用快速平板凝集法全群检疫，淘汰阳性鸡只，可疑鸡只隔离饲养，再进行复检，阳性者淘汰。

从该鸡场采集的病死雏鸡病料，经细菌分离培养、病理组织学观察、生化试验、平板凝集试验，确诊为鸡白痢沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌两种血清型混合感染所致。试验结果充分说明该鸡场受到鸡沙门氏菌感染。利用纸片法药敏试验，显示头孢呋肟、氧氟沙星、诺氟沙星、庆大霉素、卡那霉素、四环素对鸡沙门氏菌具有高敏感性。对鸡群使用头孢呋肟1.5倍饮水治疗，经过7d的治疗，鸡群基本正常，无死亡鸡只。

4.2  坚持自繁自养，如确需引进，需对引进鸡场进行鸡沙门氏菌检测咨询，确定为无鸡沙门氏菌病鸡群，方可引进。

4.3  对孵化种蛋进行全出全进制，对种蛋进行严格的熏蒸消毒，每次出完雏鸡以后，对孵化器进行彻底消毒，以便杀灭环境中的细菌。

4.4  各种应激因素：如饲养密度大、通风不良、舍内温度过高或过低、卫生条件不良、饲养管理不善都可诱发鸡只发病，应减少应激因素，改善饲养管理，提高雏鸡的营养水平，加强鸡只抵抗力。

4.5  对种鸡和雏鸡不要乱投药，应根据药敏试验结果选择敏感药物防治鸡沙门氏菌病，注意耐药菌株的出现，要定期给种鸡投药，并对鸡舍消毒，消除鸡沙门氏菌带菌污染，若一个种鸡场鸡沙门氏菌净化后未进行鸡舍消毒，不出一个月必将导致鸡沙门氏菌再次污染，重新检测时鸡沙门氏菌病阳性率增高。在防治沙门氏菌上，抗生素起了很大作用，但也带来很多的负面影响。它引起消化道正常菌群失调、产生耐药菌株、抑制机体的免疫反应等，甚至给禽产品带来药物残留。所以应该把疾病抵御在鸡场之外，最大限度地减少药物的应用。

4.6  要防止沙门氏菌病的发生，必须坚持预防第一，把沙门氏菌的检疫放到鸡场的工作程序上来，建立检疫淘汰制度和相应的饲养管理净化措施。同时要把好引种关，从鸡白痢病净化达标场引种。种鸡场更要把好种鸡检疫关，减少垂直传播，减弱白痢感染者随代次的后续扩大效应。

鸡沙门氏菌对养鸡业的危害已越来越被人们所重视，非伤寒沙门氏菌病，是人与动物肠道细菌病的主要病原[11]，目前在发达国家，沙门氏菌感染是报道最多的食源性细菌病之一[12]，鸡沙门氏菌净化工作势在必行。

参考文献：

[1]  吴清民主编.兽医传染病学[M].北京：中国农业大学出版社，2002.

[2]  甘孟侯.中国禽病学[M].北京：中国农业出版社，1999，136-137.

[3]  焦新安，刘秀梵.禽沙门氏菌病流行现状与控制对策[J].中国禽业导报，1998，15（1）：23-24.

[4]  陈自望，叶玮. 福州市鸡白痢杆菌病的血清学调查[J].养禽与禽病防治，2006（5）：5-6.

[5]  吴斌，陈明生，秦成，等.进口饲料中沙门氏菌的分离与鉴定[J].饲料工业，2003，24 （11） 51-52.

[6]  潘志明，焦新安，黄金林，等.鸡沙门氏菌弱毒冻干苗的研制[J].中国预防兽医学报，2001，4：3-4.

[7]  姚火春.兽医微生物学实验指导[M].北京：中国农业出版社，2001：16-17.

[8]  廖延雄.兽医微生物实验诊断手册[M].北京：中国农业出版，1995.

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[11]  Rabsch W，Tschpe H，Baumler AJ.Non-typhoidal salmonellosis：emerging problems[J].Microbes and Infection.2001，3：237-247.

[12]  Anonymous.WHO Surveillance programme for control of food-borne infections and intoxications in Europe. 6th report，1990-1992[J].Federal Institute for Health Protection of Consumers and Veterinary Medicine，1995，Berlin.