基于EMA—PCR检测技术研究进展

【摘要】传统的微生物的检测方法在对病原菌进行检测时会造成假阳性和假阴性的结果，将DNA结合染料叠氮溴乙锭（EMA）与PCR技术相结合，是一种有效区分微生物死活细胞的检测方法。基于EMA-PCR/qPCR的微生物检测技术是检疫性有害生物传病风险评估的新技术。

【关键词】 EMA  PCR  微生物死活菌区分  微生物检测新技术

【课题项目】重庆三峡医药高等专科学校校级苗圃工程（2014mpxz4）。

【中图分类号】G64 【文献标识码】A 【文章编号】2095-3089（2015）05-0233-01

分子生物学方法中基于PCR技术的检测方法被越来越多地应用于致病菌的检测，但是传统的PCR检测技术不仅能扩增活细胞DNA，同时自由状态的DNA或死细胞DNA也能被扩增，导致检测出现假阳性，因此一种能特异、快速、准确检测病原菌的方法极为迫切。

一、EMA-PCR检测技术原理

活菌和死菌的区别之一是细胞膜的完整性，EMA是一种DNA 结合染料，其光解后形成的氮宾化合物能够渗透进入细胞膜不完整的菌体内，与DNA分子发生不可逆的共价结合，从而抑制其PCR扩增，但不会影响活菌DNA的PCR扩增。EMA结合PCR的检测方法，仅以活菌的基因组DNA为检测靶标，能有效降低传统PCR检测的假阳性，同时能有效降低“活的但不可培养状态”（VBNC）菌在传统培养法带来的假阴性结果，使检测结果更加准确、可靠。

二、EMA-PCR检测技术应用

目前，EMA-PCR新型微生物活体检测技术已经广泛用于食品微生物、环境微生物和医学微生物的检测中。Guy等[1]用EMA结合常规PCR的方法检测屠宰场中有活性的沙门氏菌，这种EMA-qPCR方法成功地避免了检测过程中的假阳性，对食品安全评估更为准确。Pilar等[2]用v-PCR方法检测军团杆菌，结果发现，v-PCR方法与平板培养法结果比较相近或略高，但是相对于常规PCR的检测结果而言偏低或相近，表明此法能避免常规PCR检测带来的假阳性和平板培养计数法可能带来的假阴性结果，该法用于检测水体中的军团杆菌。新建立的v-PCR方法在缩短检测时间的同时保证了检测结果的准确性。Trivedi等[3]用较高的EMA浓度实时定量监测柑橘中脉中不可培养的柑橘黄龙病菌的含量，发现在感染的长春花中检测到的病原菌含量比感染的柑橘中高，对病害的流行规律研究有重要的意义。

金黄色葡萄球菌（SA）是一种常见的高致病性革兰氏阳性菌，对SA的准确检测十分重要，而检测的关键是食品中活菌是否存在和如何准确定量的问题。余以刚等[4]建立金黄色葡萄球菌VBNC状态的诱导条件模型，成功建立了DNA结合EMA与qPCR技术相结合检测VBNC金黄色葡萄球菌的方法。

EMA-PCR检测技术有效避免了传统PCR检测方法的假阳性结果和传统培养方法带来的假阴性结果，这种新型、方便、快捷、准确的微生物活体检测技术将取代传统的检测技术成为微生物检测的新思路。

参考文献：

[1]Guy RA， Kappor A， Holicka J， Shepherd D， Horgen PA. Arapidmolecular-based Assay for direct quantification of viable bacteriain slaughterhouses. Journal of Food Protection， 2006，69（6）：1265-1272.

[2]Pilar DV，Lydie S，Jean MD. Viability PCR，a Culture-Independent method for rapidand selective quantification of viable legionellapneumophilacellsin environmentalwatersamples.Applied and environmental microbiology，2009，75（11）：3502-3512

[3]Trivedi P， Sagaram US， Kim JS. et al. Quantification of viable Candidatus Liberibacter asiaticus in hosts using quantitative PCR with the aid of ethidium monoazide （EMA）.European Journal of Plant Pathology，2009，124： 553-563.

[4]余以刚，田聪，肖性龙等.金黄色葡萄球菌VBNc状态的诱导条件和EMA-qPCR检测.华南理工大学学报（自然科学版），2013，1（41）：127-129.

作者简介：

熊书（1987-），女，硕士研究生，重庆万州人，助教，研究方向：生物化学与微生物检验检疫。