高效液相色谱法测定不同产地丁香中丁香酚含量研究

张 锐，卢金清，江汉美*，周 坤，徐惠芳

(1.武汉市中医医院，湖北 武汉 430010；2.湖北中医药大学 湖北省药用植物研发中心，湖北 武汉 430065)



高效液相色谱法测定不同产地丁香中丁香酚含量研究

张 锐1，卢金清2，江汉美2*，周 坤2，徐惠芳1

(1.武汉市中医医院，湖北 武汉 430010；2.湖北中医药大学 湖北省药用植物研发中心，湖北 武汉 430065)

目的：采用高效液色谱(HPLC)法对不同产地丁香中丁香酚的含量进行比较研究。方法：采用DIONEX Acclaim120-C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)，以甲醇-水(65∶35)为流动相，检测波长为280nm，流速为1.0mL/min。结果：丁香酚在2.164～10.82μg范围内与峰面积呈良好的线性关系：Y=15.999 5X-5.712 2，r=0.999 9；平均加样回收率为99.93%(RSD=0.06%, n=6)，不同产地丁香中丁香酚的含量有显著差异，其中以印尼产丁香含量较高，其次为广东产丁香。结论：该方法操作简便、重现性好，可作为丁香中丁香酚含量的测定方法，为完善丁香质量控制体系提供科学依据。

丁香；丁香酚；高效液相色谱

丁香(EugeniacaryophyllataThunb.)为桃金娘科丁香的干燥花蕾，习称公丁香，主产于坦桑尼亚、马来西亚、印度尼西亚等地，我国自上世纪50年代开始对丁香进行引种栽培，并取得初步成功。丁香为世界名贵香料植物，是一种临床常用药物，为我国传统进口“南药”之一。丁香酚具有较广泛的药理活性，为丁香主要药效成分，具有解热、镇痛、抑菌、麻醉、抗凝、抗肿瘤和促进透皮吸收等[2]作用，对多种牙科疾病均有较好治疗效果，此外丁香酚还能清除氧自由基而达到抗氧化、延缓衰老等[3]作用。文献[3-4]报道采用比色法、高效毛细管电泳法测定丁香中丁香酚的含量，但普遍存在操作繁琐、准确度和灵敏度不高等问题。本实验采用HPLC法，以丁香酚为指标成分对不同产地丁香药材含量进行测定研究。该方法具有操作简便、快速、重现性好等特点，为种质和产地因素对丁香药材质量影响的科学评价奠定方法学基础，为进一步开发和利用丁香药材提供科学依据，现具体报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

DIONEX-U3000高效液相色谱仪；DIONEX Acclaim120-C18(4.6mm×250mm, 5μm)色谱柱；电子分析天平(CP225D，d=0.01mg)。

1.2 试药

丁香分别产自印度尼西亚(编号S1)、广东(编号S2)、云南(编号S3)、广西(编号S4)、海南(编号S5)，经湖北中医药大学生药教研室鉴定为桃金娘科植物丁香(EugeniacaryophyllataThumb.)干燥花蕾；丁香酚对照品(批号：110725-201112)，甲醇(色谱纯)，其他试剂均为分析纯，水为三蒸水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：DIONEX Acclaim120-C18(4.6mm×250mm,5μm) ；流动相：甲醇-水(65∶35)；检测波长为280nm，流速为1.0mL/min，柱温为30℃。

2.2 供试品溶液制备

取丁香药材粉末(过三号筛)0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加乙醇15mL，称定重量，超声提取30min，放冷，用乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液以0.45μm微孔滤膜滤过，即得。

2.3 对照品溶液制备

取丁香酚对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，制成丁香酚浓度为1.082mg·mL-1的溶液，即为对照品溶液。

2.4 系统适用性试验

取对照品溶液、供试品溶液及空白溶剂各10μL，按“2.1”项色谱条件检测。结果表明，丁香酚色谱峰与相邻峰达到基线分离，且分离度良好，其他组分无干扰，理论塔板数按丁香酚计算应不低于5 000。色谱见图1、图2、图3。

图1 丁香供试品溶液HPLC色谱

图2 丁香酚对照品溶液HPLC色谱

图3 空白溶剂HPLC色谱

2.5 标准曲线制备

精密吸取对照品溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0μL，注入液相色谱仪，测定峰面积值，以进样量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，得丁香酚的回归方程为：Y=15.999 5X-5.712 2, r=0.9999。结果表明，丁香酚在2.164～10.82μg范围内线性关系良好。见图4。

图4 丁香酚标准曲线

2.6 方法学考察

2.6.1 精密度试验 取“2.3”项方法制备对照品溶液5μL，参照“2.1”项色谱条件连续进样6次，测定其峰面积，丁香酚峰面积RSD为0.98%。结果表明，仪器精密度良好。

2.6.2 稳定性试验 取同一丁香供试品溶液，按“2.1”项色谱条件制备供试品溶液，精密吸取5μL，分别于0、3、6、9、12、24h注入液相色谱仪，测定峰面积。结果显示，丁香酚峰面积RSD为1.17%，表明样品溶液在24h内稳定。

2.6.3 重现性试验 取同一批丁香样品5份，每份0.5g，精密称定，照“2.2”项方法制备供试品溶液，精密吸取5μmL，注入色谱仪，记录峰面积，计算丁香酚含量的RSD为0.69%。结果表明，该方法重现性良好。

2.7 加样回收试验

取已知含量同批样品粉末6份，每份0.5g，分别加入低、中、高(加入水平依次为80.0%、100.0%、120.0%)3个水平的丁香酚对照品溶液，按“2.2”项方法制备供试品溶液，精密吸取各供试品溶液5μL注入液相色谱仪，按“2.1”项色谱条件测定，其结果见表1。

2.8 丁香酚含量测定

取不同产地5批丁香样品约0.5g，精密称定，按“2.2”项方法制备样品溶液5份，平行测定3次，取平均值，根据标准曲线计算出丁香酚含量，结果见表2。

表1 加样回收率实验结果

表2 不同产地丁香中丁香酚含量测定结果

3 讨论

试验中选择不同比例的甲醇-水、乙腈-水为流动相进行等度洗脱[5]，结果发现以乙腈-水等度洗脱时间较短，但分离效果较差；甲醇-水进行等度洗脱时间较适中，且分离效果明显优于乙腈-水系统分离效果，调整后发现以甲醇-水(65∶35)为流动相等度洗脱，在所选定色谱条件下丁香酚色谱峰与其相邻峰分离度良好，空白溶剂无干扰，故选择甲醇-水(65∶35)为流动相。

本试验采用乙醇为提取溶媒，结合超声提取丁香中丁香酚成分，以HPLC法测定5个不同产地丁香中丁香酚含量，结果表明：不同产地丁香中丁香酚含量存在较大差异，其中以印度尼西亚所产丁香中丁香酚含量较高，海南产丁香中丁香酚含量最低，其他3个产地丁香中丁香酚含量由高到低依次为广东、云南和广西。丁香原产于印度尼西亚，该地区为热带雨林气候，自上世纪50年代我国对丁香进行引种栽培，现在广东、云南、广西和海南等地已具一定的种植规模。实验结果显示，广东产丁香与印度尼西亚产丁香的丁香酚含量差异较小，海南产丁香与印度尼西亚所产丁香差异较大，广东为温带海洋气候，海南为热带季风气候，可见不同产区气候因素及光照强度、日照长短等对植物次生代谢产物的积累存在一定影响。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].一部.北京:中国医药科技出版社,2010:4.

[2] 申云翔.丁香提取物不同极性部位体外抗氧化活性研究[D].洛阳:河南科技大学,2013.

[3] 胡海清,厉辉,黄嵘.复方丁香洗剂中丁香酚和苦参碱的含量测定[J].中南药学,2004,2(4):216-218.

[4] 黄先敏,伍文聪,吴银梅,等.高效毛细管电泳法测定山茱萸中丁香酚的含量[J].安徽农业科学,2010,38(11):5612-5613,5618.

[5] 季光琼,刘艳菊,王萍,等.HPLC法测定苍术及麸炒苍术中5-羟甲基糠醛的含量[J].湖北中医杂志,2014,36(2):73-74.

(责任编辑：李岚春)

Content Determination of Eugenol inEugeniacaryophyllataThunb. from Different Origin by HPLC

Zhang Rui1,Lu Jinqing2,Jiang Hanmei2*,Zhou Kun2.Xu Huifang1

(1.Chinese Medicine Hospital of Wuhan, WuHan 430010, China;2.Hubei Medicinal Plants R&D Center, Hubei University of Traditional Chinese Medicine, WuHan 430065,China)

Objective:High-performance liquid chromatography(HPLC) was conducted to comparative analysis the content of eugenol Eugenia caryophyllata Thunb. from different origin. Methods:The ZORBAX SB-C18(4.6mm×250mm, 5μm) column was used with the mobile phase of methanol-water (65:35) at the detection wavelength of 280nm and the flow rate was 1.0ml/min. Results:Analysis showed that the linear relationship of eugenol quality and peak areas was in the range of 2.164～10.82μg, the average recovery was 99.93% (RSD=0.06%, n=6).There is a significant difference in the eugenol content of clove in different habitats which the most higher content of eugenol was Indonesia and Guangdong clove followed.Conclusion:The method is simple, reproducible, and can be used in the determination of cloves eugenol content which provide a scientific basis for improving cloves' quality control system.

Clove; Eugenol; HPLC

2015-01-27

张锐(1988-)，女，武汉市中医医院药师，研究方向为中药制剂。Email：496372737@qq.com

江汉美(1960-)，女，湖北中医药大学副教授，硕士生导师，研究方向为中药制剂。Email：jianghm-666@163.com

R284

A

1673-2197(2015)12-0036-02

10.11954/ytctyy.201512016