斑马鱼对水源特定污染物的水质监测预警

马中雨，陈家全，陈兴厅，宋武昌，逯南南，孙韶华，贾瑞宝

山东省城市供排水水质监测中心，山东 济南 250021

生物监测预警是一种利用鱼类、发光菌、水蚤等受试生物作为生物传感器监测水质变化、判断其是否受到污染并对污染程度进行评价的方法。鱼类对水环境的变化非常敏感，在外部环境压力下，鱼类的行为会发生相应的变化，所以，通过监测鱼类的行为变化可以实现水质污染事件的在线报警。目前，鱼类行为生态学是国内外科研工作者研究的焦点之一［1-5］，国内外已经有多种生物鱼在线监测预警系统应用于水质在线监测［6-9］，但是斑马鱼在水质生物预警系统中的应用研究报道较少。该研究以斑马鱼为受试生物，利用水质在线生物安全预警系统分析斑马鱼在6种环境污染物下的行为变化及系统报警特征，为饮用水水源突发水污染的生物监测预警提供参考。

1 实验部分

1.1 监测系统

在斑马鱼行为在线监测中，采用水质安全在线生物预警系统(BEWs-3，中国科学院生态研究中心研制，示意图见图1)进行。该系统主要由生物传感器、信号采集处理系统、信号分析评估系统及显示器组成。其预警原理是在一定环境压力下，生物行为反应是外界环境和内部生理变化的外在体现，所以生物行为变化可以起到环境变化警示作用，通过生物行为监测系统在线监测斑马鱼在水体污染情况下行为强度变化，达到监测被测水体污染状况的目的。在斑马鱼行为监测过程中，采用直径为5 cm、长7 cm的圆柱形生物传感器。

图1 水质安全在线生物预警系统示意图

1.2 受试生物

斑马鱼(Zebrafish)，属真骨鱼总目、鲤科，是一种敏感的水生模式生物，其生物学背景研究充分，对多种有毒化学物质或环境污染物敏感，被国际标准化组织列为毒性实验受试种之一，国内外被广泛应用于多种有毒化学物质的生态风险评估。因此，选择斑马鱼为生物传感器开展研究工作。选择的斑马鱼长(30±5)mm、重(0.3 ±0.1)g。

1.3 实验设计

采用动态水流监测斑马鱼的行为反应。在污染物暴露实验中，针对黄河下游地区引黄供水系统水源浊度高、同时面临有机物和重金属污染风险的情况，选择浊度、亚硝酸盐氮、石油类、苯、砷化物、锰等6个指标，分别测试其对斑马鱼的行为毒性。实验过程中，为了明确生物综合行为的变化，采用生物综合行为强度(Behavior Strength)来反映其行为变化，在此过程中，判断生物行为强度发生剧烈变化的标准:变化以前连续5次行为强度平均值与变化以后连续5次行为强度平均值差异达到20%以上。

在受试生物动态实验过程中，实验开始每个通道保持2条体长2.5～3 cm的受试鱼，直至实验结束。实验过程中不喂食，并控制每个通道水流量为2 L/h。

实验过程中生物暴露的污染物浓度参考《地表水环境质量标准》(GB 3838—2002)III类水体中限值以及生物监测方法的灵敏度2个因素，除浊度和苯外，其他指标均选择标准浓度的5倍和10倍，浓度设置见表1。

采用地表水加标方式调整实验浓度，加标物质及其参数如表2所示。在不同浓度污染物暴露过程中采用6组平行，监测周期24 h，并通过平均值反映斑马鱼的行为反应，在此基础上评价斑马鱼的敏感性。

表1 实验中各污染物浓度设置

表2 加标物质及其参数

2 结果与分析

2.1 斑马鱼在不同污染物下的行为变化

利用水质安全在线生物预警系统分别测定了斑马鱼在浊度、石油类、亚硝酸盐氮、砷、锰、苯6个指标下的行为强度变化，实验结果见图2～图7，图中各对照均为纯水。

由图2可以看出:在浊度为10.1 NTU时，斑马鱼行为强度没有受到显著的影响;而当浊度为53.8 NTU时，斑马鱼在暴露11 h后行为强度开始缓慢下降，2 h后行为强度降到最低，下降幅度为13.7%，其后行为强度缓慢恢复。总体上看，浊度为10、53.8 NTU的水溶液对斑马鱼行为强度的影响不显著。

当斑马鱼在石油类质量浓度为0.25 mg/L的水体中暴露时，10 h后行为强度开始缓慢下降;暴露21 h后，行为强度恢复到初始状态，未出现报警信息;而在石油类质量浓度为0.5 mg/L的水体中暴露时，4 h后行为强度开始下降，22 h后行为强度恢复到开始状态，也未出现报警信息，见图3。可见，石油类对斑马鱼行为强度的影响有一定的剂量效应。

图2 斑马鱼在不同浊度下行为变化情况

图3 斑马鱼在不同浓度石油类条件下行为变化情况

图4 斑马鱼在不同浓度亚硝酸盐氮条件浊度下行为变化情况

图5 斑马鱼在不同浓度锰条件下行为变化情况

图6 斑马鱼在不同浓度砷条件下行为变化情况

图7 斑马鱼在不同浓度苯条件下行为变化情况

由图4可知，斑马鱼在亚硝酸盐氮质量浓度为5 mg/L的溶液中暴露24 h后，没有明显差异，未出现报警;而在浓度质量达到10 mg/L时暴露10 h后即出现报警。

斑马鱼分别暴露在质量浓度为0.5 mg/L和1 mg/L的锰溶液中时，分别暴露1 h和1.5 h后即出现报警，除对照外其余通道鱼全部死亡，结果见图5。这说明生物鱼系统对重金属锰的灵敏性较好，反应敏感。

由图6可见，斑马鱼在砷质量浓度为0.25 mg/L的溶液中暴露1 h后行为强度开始缓慢下降，7 h后斑马鱼行为强度降到0.2以下，全部死亡，0.5 h后即出现报警。在砷质量浓度为0.5 mg/L时暴露10 min后行为强度开始下降，1.2 h后行为强度下降到0.2以下，除对照外均死亡，1.7 h后出现报警。可见，斑马鱼对砷反应的剂量效应非常明显。

由图7可见，斑马鱼在质量浓度为0.25、0.5 mg/L苯溶液中暴露时，均有报警，报警时间分别是实验开始后14.25和3 h，2种浓度下均全部死亡;随着苯浓度的提高，对其行为的影响也显著增强。这说明苯对斑马鱼具有较高的毒性。

在24 h暴露过程中，对照组内斑马鱼行为未随时间的变化而发生行为强度的明显升高或降低，同时，实验结果表明:在同一污染物暴露下，生物行为强度随暴露时间变化而变化，也会随暴露浓度的变化而变化。在浊度、石油类、亚硝酸盐氮、苯、砷、锰等高浓度的污染水体暴露下，斑马鱼的行为强度都有所下降，下降幅度分别为13.7%、37.7%、35.4%、62.1%、90%、95%，而在较低浓度的污染水体中，斑马鱼行为强度下降幅度分别为0、18.6%、0、10.2%、90%、95%，结果见表 3。

表3 斑马鱼在各污染物暴露下的行为强度变化分析

由表3可见，不同的污染物及其浓度对斑马鱼的行为强度产生了不同的影响，反映了不同污染物对斑马鱼毒性作用的不同，而这也为利用水质安全在线生物预警系统监测水质变化、判断水质污染物的类型提供了线索。

2.2 在线生物预警系统报警特征与斑马鱼行为变化之间的关系

在水质安全在线生物预警系统中，生物鱼是整个系统的生物传感器，其作用是感知水质变化，并通过行为上的变化来反映水质的变化。生物鱼行为变化的极端情况是在污染物毒性作用下失去行为能力甚至死亡。在实验中，生物鱼的死亡率与预警系统的报警结果见表4。

由表4可以看出，不同污染物对斑马鱼的毒性作用存在较大差异。在浊度、石油类的低浓度和高浓度溶液中，受试生物鱼死亡率均为0;在亚硝酸钠氮、苯的低浓度溶液中，受试生物鱼未见死亡，在高浓度溶液中，均有死亡;在砷和锰的高、低浓度溶液中，受试生物鱼死亡率为100%。这一结果与生物鱼行为强度的变化相吻合。生物预警系统出现报警的情况与生物鱼死亡的情况具有很好的相关性。生物预警系统不仅能够在受试生物鱼全部死亡时报警，而且在生物鱼因为毒性物质的作用出现部分死亡时也能够报警，而在没有生物鱼死亡的情况下无报警。另外，对于不同类型的污染物，仪器出现报警的反应时间也不同。例如:在0.5 mg/L亚硝酸钠氮溶液中，暴露10 h后仪器发出报警;而在0.5 mg/L锰溶液中，暴露1 h后即发出报警。这一结果也与生物鱼行为强度变化相吻合。

表4 不同污染状况下斑马鱼行为变化及在线报警特征

3 讨论

在线生物监测技术通过生物传感器监测水体内受试水生生物不同水平上的生物学指标变化，预警水质的变化，实现对环境的在线监测，实时对水环境污染与否、污染的严重性做出在线评价。该技术已经在多个国家应用于水体突发性污染事故的在线预警［10-13］。在线生物监测技术的核心是通过生物传感器监测到在环境污染物压力下的各种生物信号，经过处理器处理以后，再由计算机将处理后的数字信息以可视信号显示出来，达到在线生物监测的目的。大量的研究表明［14-16］，生物的行为生态学变化与环境污染物压力存在显著的相关性。本研究结果表明:生物鱼的行为生态学变化与环境压力大小直接相关，在高浓度污染物的环境内，生物鱼的行为生态学出现剧烈变化;生物鱼的行为生态学变化与在一定压力环境内的暴露时间直接相关，随着暴露时间的增长，生物鱼的行为生态学变化会逐渐降低;生物鱼的行为生态学变化随环境压力的变化而不同。

不同地区的地表水水质具有不同的特征性污染物，如济南的引黄水库水具有高藻、高有机物的水质特征［17］。根据本研究结果，按照斑马鱼行为强度及报警时间，可以将浊度、石油、亚硝酸盐、苯、砷、锰划分为3类指标:浊度和石油，这2个指标对斑马鱼行为强度影响较小，生物鱼未出现死亡和报警情况;亚硝酸盐氮和苯，这2个指标对斑马鱼的行为强度影响居中，都只在高浓度下报警;砷和锰，这2个指标对生物鱼行为强度影响最显著，报警时间也较短。所以，在利用在线监测技术监测水源水质时，要结合当地的水质特征开展研究，对设备预警参数进行优化，设定更加符合水质特征的报警阈值。

另外，斑马鱼是热带鱼种，存在对环境适应性的问题，应该加强研究，开发适合当地的鱼种，应用于水质安全预警。

4 结论

斑马鱼的行为生态学变化与环境污染物压力存在显著的相关性。斑马鱼的行为生态学变化与环境压力大小直接相关，在高浓度污染物的环境内，斑马鱼的行为生态学出现剧烈变化;斑马鱼的行为生态学变化与在一定压力环境内的暴露时间直接相关，随着暴露时间的增长，斑马鱼的行为生态学变化会逐渐降低;斑马鱼的行为生态学变化随环境压力的变化而不同;水质在线生物安全预警系统对不同类型污染物的反应灵敏度不同，应结合当地的水质特征设定报警阈值。

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