氟喹诺酮类药物粉剂中非法添加四种喹噁啉类药物的UPLC检测方法研究

罗成江，陆春波，林仙军，周志强，周芷锦，蔡文金，陈晓林，应永飞

（浙江省兽药饲料监察所，杭州311101）

氟喹诺酮类药物粉剂中非法添加四种喹噁啉类药物的UPLC检测方法研究

罗成江，陆春波，林仙军，周志强，周芷锦，蔡文金，陈晓林，应永飞∗

（浙江省兽药饲料监察所，杭州311101）

建立了超高效液相色谱法测定氟喹诺酮类药物粉剂中非法添加喹乙醇、乙酰甲喹、卡巴氧及喹烯酮的方法。采用purospher RP－18色谱柱（2.1 mm×100 mm，粒径2.0 μm）分离四种喹噁啉类药物，以磷酸溶液和甲醇－乙腈（7.5∶7.0）为流动相进行梯度洗脱，流速0.3 mL／min，二极管阵列检测器检测，采集波长范围为200～400 nm，分辨率为1.2 nm，记录光谱图和365 nm波长处的色谱图。结果显示，四种喹噁啉类药物的浓度在0.2～100 μg／mL范围内的线性良好，相关系数r均为0.9999，回收率在98.0%～100.2%范围内，RSD在0.27%～0.89%之间，检测限200 mg／kg。本方法快速、准确，可用于氟喹诺酮类粉剂中非法添加喹噁啉类药物的定性和定量检测。

氟喹诺酮类药物；粉剂；喹噁啉类药物；超高效液相色谱法

喹噁啉类药物具有抗菌效果好、促生长、价格便宜等优点，被广泛用于畜牧业生产中，但由于不正确使用，或者被一些不法分子违规使用，导致中毒事件时有发生。而且该类药物在动物源性食品中残留对人体具有潜在致癌性，同时还会诱导细菌产生耐药性的可能，因此国际上大多数国家将其列为禁用、限用药物［1］。另一方面，自20世纪60年代氟喹诺酮类抗菌药问世以来，因其具有抗菌谱广、杀菌力强、吸收快、体内分布广泛、不良反应小，与其他抗菌药无交叉耐药性等特点，被广泛应用于治疗动物各类感染［2］。近年来，一些不法分子在经济利益的驱使下，非法在氟喹诺酮类药物制剂中非法添加喹噁啉类药物，以达到更好药效、更低成本且又更加隐蔽的目的。为了打击氟喹诺酮类药物制剂中非法添加喹噁啉类药物的情况，我国制订了氟喹诺酮类制剂中非法添加乙酰甲喹、喹乙醇等化学药物检查方法［3］，但此公告中仅涉及乙酰甲喹、喹乙醇的检测，尚未对喹烯酮和卡巴氧进行检测。因此建立一种准确、高效地同时测定氟喹诺酮类制剂中乙酰甲喹、喹乙醇、喹烯酮和卡巴氧非法添加的检测方法十分必要。本研究在参考了相关文献［4］的基础上，建立了UPLC法测定氟喹诺酮类药物粉剂中非法添加喹噁啉类药物的定性定量检测方法。

1 材料

1.1 仪器 Waters Acquity UPLC超高效液相色谱仪－二极管阵列检测器；AG－285电子天平（Mettler公司）；DELTA320 pH计（Mettler公司）；KQ－500E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 药品与试剂

1.2.1 对照品 乙酰甲喹、喹乙醇、恩诺沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、卡巴氧、喹烯酮对照品均来自中国兽医药品监察所，含量大于99.0%；环丙沙星对照品来自中国食品药品研究院，批号 130451－201203，含量84.2%。

1.2.2 试剂 磷酸，分析纯，杭州高晶精细化工有限公司；三乙胺，分析纯，江苏强盛功能化学股份有限公司；乙腈、甲醇，色谱纯，Merck KGaA公司；水，超纯水。

1.2.3 供试品

1.2.3.1 阴性氟喹诺酮类粉剂 恩诺沙星可溶性粉，盐酸环丙沙星可溶性粉，诺氟沙星粉，氧氟沙星可溶性粉均来自市售样品，经检测均不含乙酰甲喹、喹乙醇、喹烯酮、卡巴氧。

1.2.3.2 阳性添加氟喹诺酮类粉剂 在阴性氟喹诺酮类粉剂中分别添加乙酰甲喹、喹乙醇、喹烯酮、卡巴氧对照品，混匀，根据喹噁啉类药物添加达到一定药效和市场临床使用剂量，共添加3个含量，分别为0.5%、1.0%和2.5%。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液的制备 取喹乙醇、乙酰甲喹、卡巴氧和喹烯酮对照品约25 mg，分别置50 mL量瓶中，加流动相A（磷酸3.0 mL加水1000 mL，用三乙胺调pH值至3.0，加乙腈50 mL，摇匀，即得）适量，超声处理使溶解并稀释至刻度，摇匀制成0.5 mg／mL的对照品储备液。分别取恩诺沙星、诺氟沙星、氧氟沙星和环丙沙星对照品约25 mg置于50 mL量瓶中，加流动相A适量，超声处理使溶解并稀释至刻度，摇匀制成0.5 mg／mL的氟喹诺酮类药物储备液。

2.1.2 供试品溶液的制备 分别称取1.2.3.2项下的阳性添加样品0.5 g于50 mL量瓶中，加流动相A适量，超声处理使溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取1 mL，置10 mL量瓶中，用流动相A稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

2.1.3 光谱数据库溶液的制备 以喹乙醇、乙酰甲喹、卡巴氧和喹烯酮对照品溶液（50 μg／mL）作为建立光谱数据库的溶液。

2.2 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱为Purospher RP－18（2.1 mm×100 mm，2.0 μm）；以磷酸溶液（磷酸3.0 mL加水1000 mL，用三乙胺调pH值至3.0，加乙腈50 mL，摇匀，即得）为流动相A；以甲醇：乙腈（7.5∶7.0）为流动相B，按表1进行梯度洗脱；采用二极管阵列检测器，采集波长范围为200～400 nm，分辨率为1.2 nm，柱温30℃；记录光谱图和365 nm波长处的色谱图。分别精密量取2.1.1项下的乙酰甲喹、喹乙醇、喹烯酮和卡巴氧对照品储备液1 mL，恩诺沙星、诺氟沙星、氧氟沙星和环丙沙星对照品储备液10 mL，置于同一50 mL量瓶中，加流动相A稀释至刻度，摇匀，为系统适用性试验溶液，量取5 μL注入超高效液相色谱仪，记录色谱图。该条件下，按出峰时间先后顺序依次是喹乙醇、乙酰甲喹、氧氟沙星、诺氟沙星、卡巴氧、环丙沙星、恩诺沙星和喹烯酮，相邻色谱峰的分离度符合要求，结果见表2，色谱图和光谱图分别见图1、图2。

表1 流动相组成和流速

表2 系统适用性试验数据

图1 系统适用性实验色谱图

2.3 峰纯度和光谱相似度检查 对供试品溶液色谱图中四种喹噁啉类药物色谱峰进行峰纯度检查以及对供试品溶液中喹乙醇、乙酰甲喹、卡巴氧和喹烯酮的光谱图与光谱库进行匹配，结果见表3。结果表明，各色谱峰的纯度角度均小于纯度阈值，此色谱条件下，四种喹噁啉类药物的出峰位置无其他干扰峰，为单一物质峰，方法可行；PDA匹配角度均小于匹配阈值，供试品溶液中相应色谱峰的光谱与喹乙醇、乙酰甲喹、卡巴氧和喹烯酮光谱库的光谱理想匹配，可认为是同一物质。

图2 4种喹噁啉类药物的光谱图

表3 峰纯度检查结果表

2.4 线性关系考察 分别精密量取2.1.1项下4种喹噁啉类药物标准储备液，用流动相A稀释成0.2、0.5、1、5、10、25、100 μg／mL的系列混合标准溶液，从低浓度到高浓度依次进样，按上述色谱条件分析，以峰面积为纵坐标、标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，求得回归方程相关系数，结果见表4。

表4 4种喹噁啉类药物的线性结果表

2.5 添加回收试验 按1.2.3.2项下阳性添加样品，每个浓度做5份平行样，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，进行仪器分析。按照外标法定量，回收率结果见表5。从回收率结果可以看出，本方法回收率为98.0%～100.4%，RSD在0.27%～0.89%之间。

2.6 检测限 按2.1.1项下的4种喹噁啉类药物储备液制成混合标准溶液，进行梯度稀释后添加到阴性对照氟喹诺酮类粉制剂中，按2.2项下的方法进行检测，光谱未失真的最低添加含量作为检测限，此时光谱图和色谱图分别见图3、图4。本方法的检测限为200 mg／kg。

2.7 耐用性 从柱温、流动相pH值、色谱柱三个方面考察色谱条件的耐用性。分别改变柱温为25、30、35℃，流动相A的pH值2.8、3.0、3.2，色谱峰出峰顺序无变化，保留时间稍有变化；使用不同品牌、不同型号的色谱柱，如MERCK Purospher RP－18（2.1 nm×100 mm，2.0 μm）；ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 nm×100 nm，1.7 μm）；ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 nm×100 nm，1.8 μm）等，结果八种成分仍能很好地分离且保留时间合理。在最佳实验条件的选择中流速的变化对八种成分的影响也不大，本方法建立的色谱条件耐用性较好。

表5 回收率试验结果

图3 4种喹噁啉类药物的检测限光谱图

图4 4种喹噁啉类药物的检测限色谱图

2.8 专属性试验 取系统适用性实验的混合标准溶液进行试验，采用二极管阵列检测器检测，4种喹噁啉类药物能够很好的分离，4种氟喹诺酮类药物均不干扰喹噁啉类药物的检测。

3 讨论与分析

3.1 流动相的选择 本实验涉及4种氟喹诺酮类药物与4种喹噁啉类药物的有效分离。喹诺酮类药物的母体结构相同，理化性质极为相似，因此仅选择乙腈作为有机相不能完全分离［5］。考虑到乙腈较甲醇的反相洗脱强度大，故在流动相中加入适量甲醇，以此来降低反相洗脱强度，达到分离选择性微调的目的［6］。再对水相、乙腈和甲醇进行三因素三水平正交设计，最终确定流动相比例。在实现8种组分有效分离的情况下，采用等度洗脱，喹烯酮出峰时间过长，为了提高实验效率，选择了梯度洗脱。

3.2 色谱柱的选择 因喹诺酮类药物与喹噁啉类药物理化性质相近，实现完全分离的难度很大，本实验采用C18柱，比较了不同品牌、不同规格色谱柱对分离效果的影响，结果表明均达到了较好的分离效果。采用填料粒径较小的色谱柱，大大提高了分离效率，在本文建立的条件下，8种化合物实现了基线分离。

3.3 定性条件的优化 方法采用二极管阵列检测器进行测定，可以有效监测喹乙醇、乙酰甲喹、卡巴氧、喹烯酮是否受到其它物质的干扰，同时利用二极管阵列检测器的扫描功能，进行光谱相似度检查锁定非法添加药物，大大提高了定性检测的准确性。同时通过保留时间与对照品进行对比确认，实现了喹诺酮类药物粉剂中非法添加喹噁啉类药物的高效、快速、准确识别。

［1］刘发全，曾明华，许世富，等.同时测定饲料中乙酰甲喹、喹乙醇、喹烯酮3种药物方法的研究［J］.现代农业科技，2008，（24）：230－232.

［2］方忠意，班付国，周红霞，等.氟苯尼考粉中非法添加四种喹诺酮类药物的 HPLC检测方法研究［J］.中国兽药杂志，2013，47（3）：34－37.

［3］中华人民共和国农业部公告第1868号－氟喹诺酮类制剂中非法添加乙酰甲喹、喹乙醇等化学药物检查方法［S］.

［4］贾振民，吴宁鹏，宋志超，等.高效液相色谱法测定中兽药制剂中喹噁啉类药物［J］.中国兽药杂志，2010，44（3）：13－15.

［5］于慧娟，毕世川.反相离子对液相色谱法同时测定11种氟喹诺酮类药物的研究［J］.分析实验室，2007，12（26）：23－26.

［6］刘自扬，董玲玲，范 强，等.HPLC－PDAD法检测3种中兽药散剂中违规添加4种喹诺酮类药物的研究［J］.中国兽药杂志，2014，48（4）：29－31.

（编 辑：李文平）

Determination of Four Kinds of Illegal Additives Quinoxalines in Quinolones Powder by UPLC

LUO Cheng－jiang，LU Chun－bo，LIN Xian－jun，ZHOU Zhi－qiang，ZHOU Zhi－jin，CAI Wen－jin，CHEN Xiao－lin，YING Yong－fei∗
（Zhejiang Provincial Supervisory Institute of Veterinary Drug and Feedstuff，Hangzhou311101，China）

A method for the determination of olaquindox，maquindox，carbadox，quinocetone in quinolones powder by UPLC was developed.Purospher RP－18 column（2.1 mm×100 mm，2.0 μm）was used with the mobile phase consisted of phosphoric acid solution and methanol－acetonitrile（7.5∶7.0）.The flow rate was 0.3 mL／min；the column temperature was 30℃；the wavelength range was 200～400 nm.The result showed that the standard curves for four quinoxalines were in good linearity within a concentration range of 0.2～100 μg／mL（r＝0.9999），the recoveries for quinoxalines in quinolones powder ranged from 98.0%to 100.2%with theRSDfrom 0.27%to 0.89%.The limit of detection（LOD）was 200 mg／kg.The method was fast and accurate，and was suited for identification and determination of the quinoxalines in quinolones powder.

quinolones；powder；quinoxalines；UPLC

2015－02－02

A

1002－1280（2015）04－0024－06

S859.79

浙江省农业厅中青年科技创新计划项目（2013061）

罗成江，兽医师，从事兽药、畜产品安全检测技术研究。

应永飞。E－mail：yyf1001＠163.com