UPLC－MS／MS法测定3种中兽药制剂中非法添加的阿莫西林和氨苄西林

乔 颖，刘雪红，董弘扬，侯 颖，王 驰，李 娟，张艺多

（1.大连市兽药饲料监察所，辽宁大连116037；2.大连市沙河口区食品药品监督所，辽宁大连116021）

UPLC－MS／MS法测定3种中兽药制剂中非法添加的阿莫西林和氨苄西林

乔 颖1，刘雪红1，董弘扬2，侯 颖1，王 驰1，李 娟1，张艺多1

（1.大连市兽药饲料监察所，辽宁大连116037；2.大连市沙河口区食品药品监督所，辽宁大连116021）

应用超高效液相色谱－串联质谱技术，建立了3种中兽药制剂中非法添加阿莫西林和氨苄西林的检测方法。样品经50%乙腈水溶液提取、稀释后进行分析。实验采用0.2%甲酸乙腈溶液与0.2%甲酸水溶液作为流动相进行梯度洗脱，经Atlantis T3柱（2.1 mm×150 mm，5 μm）分离，通过多反应监测模式进行测定。结果表明，阿莫西林和氨苄西林在1～50 ng／mL的范围内线性关系良好，最低检测限分别为0.5 mg／g和0.2 mg／g。阿莫西林回收率在83.4%～95.8%之间，RSD为2.0%～4.6%；氨苄西林回收率在85.1%～97.2%，RSD为1.7%～4.0%。本方法准确、可靠，可用于中兽药制剂中非法添加阿莫西林和氨苄西林的检测。

中兽药制剂；阿莫西林；氨苄西林；超高效液相串联质谱法

阿莫西林与氨苄西林，均属于β－内酰胺类抗生素。主要用于革兰氏阳性球菌和革兰氏阴性菌感染，如巴氏杆菌病、大肠杆菌病、白痢、沙门氏菌病、葡萄球菌、链球菌感染；肠道感染、肠毒综合症辅助治疗等［1］。因其良好的治疗作用，被非法添加到一些中兽药制剂中，以增强中兽药制剂的治疗效果，但是，这种非法添加会导致在畜禽疾病治疗过程中，对阿莫西林和氨苄西林的使用对象和使用剂量失去有效控制，诱使畜禽耐药菌的产生，造成畜产品药物残留等问题，进而再通过食物链的传递过程，给人类健康带来严重危害，如过敏反应、增强细菌耐药性等［2］。目前，尚没有针对中兽药制剂中非法添加阿莫西林和氨苄西林检测方法研究的报道，本研究建立了3种中兽药制剂非法添加阿莫西林和氨苄西林的UPLC－MS／MS测定方法。

1 材料

1.1 仪器设备 XEVO TQ－S ACQUITY超高效液相色谱－串联质谱仪，配置电喷雾离子源，美国Waters公司；电子天平RD－200，德国Sartorius公司；超声波清洗机；离心机RJ－TDL－40B；涡旋振荡器。

1.2 药品与试剂

1.2.1 对照品 阿莫西林，批号K0221206，含量86.4%，由中国兽医药品监察所提供；氨苄西林，批号130410－201207，含量86.5%，由中国食品药品检定研究院提供。

1.2.2 供试品 白头翁散：江西快康动物保健品有限公司，批号20140503；止痢散：郑州金大众动物药业有限公司，批号20131303；乌梅散：广西大银田兽药有限公司，批号130601。以上3种中兽药制剂经检测均不含阿莫西林和氨苄西林。

1.2.3 试剂 乙腈色谱纯、乙腈分析纯、甲酸色谱纯、水为符合GB／T 6682－1992规定的一级水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Atlantis T3 2.1 mm×150 mm， 5 μm；流动相 A：0.2%甲酸乙腈溶液；流动相 B：0.2%甲酸水溶液；流速0.3 mL／min；柱温30℃；进样量5 μL，液相色谱梯度洗脱程序见表1。

2.2 质谱条件 电喷雾离子源；正离子扫描（ESI＋）；多反应监测（MRM）；离子源温度150℃；脱溶剂气流速650 L／h；脱溶剂气温度350℃；毛细管电压3 kV。定性、定量离子对和对应的锥孔电压及碰撞能量见表2。

表1 梯度洗脱程序表

表2 定性、定量离子对和锥孔电压及碰撞能量表

2.3 样品制备

2.3.1 标准贮备液的配制 精密称取阿莫西林和氨苄西林对照品适量，分别置于25 mL量瓶中，加50%乙腈水溶液溶解，并定容至刻度，混匀，配制得到1 mg／mL的标准贮备液。

2.3.2 标准曲线工作溶液的配制 精密量取标准贮备液适量，用初始比例流动相稀释，制成浓度分别为1、2、5、10、20、50 ng／mL的标准曲线工作溶液。

2.3.3 阴性对照样品 取经检测不含阿莫西林和氨苄西林的白头翁散、止痢散、乌梅散各1 g，作为阴性对照样品。

2.3.4 阳性添加样品的制备 分别精密称取5、10、20 mg阿莫西林和氨苄西林对照品，加入到3种阴性对照样品中，配制成5、10、20 mg／g的阳性添加样品。

2.4 样品处理 精密称取中兽药制剂1 g，置于100 mL具塞锥形瓶中，加入 50%乙腈水溶液100 mL，超声提取10 min；4000 r／min离心5 min；精密移取上清液，用初始比例流动相稀释10000倍后，过0.22 μm滤膜后供测定用。

2.5 结果

2.5.1 专属性 取3种中兽药制剂的阴性对照样品溶液以及阳性添加样品溶液，按既定检测方法进行分析，其定量离子MRM色谱图分别见图1、图2、图3。结果表明，在此条件下，在阿莫西林和氨苄西林的出峰处无干扰。

图1 白头翁散阳性添加阿莫西林和氨苄西林样品（5 mg／g）及阴性对照样品定量离子MRM色谱图

图2 止痢散阳性添加阿莫西林和氨苄西林样品（5 mg／g）及阴性对照样品定量离子MRM色谱图

图3 乌梅散阳性添加阿莫西林和氨苄西林样品（5 mg／g）及阴性对照样品定量离子MRM色谱图

2.5.2 标准曲线 取2.3.2项下系列标准曲线工作溶液，浓度由低到高依次分析，以定量离子色谱峰峰面积为纵坐标，对照品浓度（ng／mL）为横坐标绘制标准曲线。在1～50 ng／mL的浓度范围内，阿莫西林的回归方程为y＝163.23＋796.52x，相关系数R2＝0.9998；氨苄西林的回归方程为y＝1412.8＋4838.4x，相关系数R2＝0.9999。从回归方程及相关系数可以看出，阿莫西林和氨苄西林在1～50 ng／mL的范围内线性关系均良好。

2.5.3 最低检测限 分别取各阳性添加样品，按2.4项的方法进行处理，用初始比例流动相进行逐级稀释，以信噪比的3倍为最低检出限，测得阿莫西林在3种中兽药制剂中的最低检出浓度为0.5 ng／mL，最低检测限为0.5 mg／g；氨苄西林在3种中兽药复方制剂中的最低检出浓度为0.2 ng／mL，最低检测限为0.2 mg／g。

2.5.4 精密度 取5 ng／mL含阿莫西林和氨苄西林的混合标准工作溶液，按既定的液相条件和质谱条件，重复进样6次，计算相对标准偏差RSD，阿莫西林的RSD为1.1%，氨苄西林的RSD为1.4%。结果表明，该方法的精密度良好。

2.5.5 准确度 分别取不同添加浓度的各阳性添加样品，每个样品6份，按2.4项的方法进行处理，经测定，计算回收率和RSD，结果见表3、表4。从表中试验结果可以看出，阿莫西林在3种中兽药制剂的平均回收率在83.4%～95.8%，RSD在2.0%～4.6%；氨苄西林在3种中兽药制剂的平均回收率在85.1%～97.2%，RSD在1.7%～4.0%，表明该方法回收率较好，准确度高。

表3 3种中兽药制剂中添加阿莫西林回收率试验结果表 （n＝6）

表4 3种中兽药制剂中添加氨苄西林回收率试验结果表 （n＝6）

2.5.6 稳定性 取上述2.5.5项下制备的供试液（添加浓度5 mg／g，n＝6），分别于0、4、8、12、24 h进样测定，记录峰面积，结果见表5。从表中结果可以看出，样品溶液在24 h内稳定性良好。

表5 稳定性试验结果表 （以峰面积平均值计，n＝6）

3 讨论与小结

3.1 中兽药制剂种类的选择 白头翁散具有清热解毒，凉血止痢之功效，用于治疗大肠杆菌等引起的毒性脓痢等；止痢散具有止痢化湿之功效，用于腹泻、止痢、大肠杆菌病等；乌梅散具有清热解毒，涩肠止泻之功效，用于幼畜禽的止泻［3］。而阿莫西林和氨苄西林对革兰氏阴性杆菌，如大肠杆菌、巴氏杆菌等有较好的抗菌作用，常用于治疗大肠杆菌病、痢疾等。由于其抗菌效果好、价格低廉，在畜禽养殖中极有可能被非法添加到以上具有类似功能主治的中兽药制剂中，故选择以上3种中兽药制剂作为代表来建立阿莫西林和氨苄西林非法添加的测定方法。

3.2 阳性添加浓度的选择 根据阿莫西林、氨苄西林以及3种中兽药制剂在畜禽疾病治疗过程中的使用量，将阿莫西林和氨苄西林的治疗量折算到3种中兽药制剂的使用量中来计算其在中兽药制剂的阳性添加浓度，最终选择阿莫西林和氨苄西林的阳性添加浓度均为5、10、20 mg／g。

3.3 检测方法的选择 阿莫西林和氨苄西林，均属于β－内酰胺类抗生素，常用的检测方法包括微生物法、免疫分析法、高效液相色谱法以及高效液相色谱串联质谱法等。其中微生物法，过程复杂，干扰较多，特异性低［4］；免疫分析法专属性差，假阳率高［5－6］；而高效液相色谱法，需要进行衍生化，操作繁琐［7－8］。本文采用高效液相色谱串联质谱法，该方法专属性强，灵敏度高，分析时间短，适用于对中兽药制剂中非法添加的快速、准确定性定量检测。

3.4 样品处理方法的选择 中兽药制剂与肌肉、肝、血液等样品相比，无蛋白及脂肪的干扰，无需过固相萃取柱净化［9－10］，且中兽药制剂添加量较大，无需浓缩。经过对2种β－内酰胺类药物的反复试验，50%乙腈水溶液对药物有很好的溶解性，因此样品的提取溶剂选用50%乙腈水溶液。样品经过超声提取，提取效率高，同时考察超声时间，发现超声10 min时，已足以将非法添加药物提取完全。

本文建立的超高效液相色谱－串联质谱方法，可用于检测中兽药制剂白头翁散、止痢散、乌梅散中非法添加的阿莫西林和氨苄西林。该方法样品前处理简便快速、检测时间短，灵敏度高，线性关系良好，准确、可靠。

［1］中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二○一○年版（一部） ［S］.

［2］马昊楠.抗生素残留与人体健康—禽类养殖中抗生素的滥用［J］.首都医药，2014，23：23－24.

［3］中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二○一○年版（二部） ［S］.

［4］吴 遐，绍 辉，王 鑫，等.试管扩散法检测牛乳中β－内酰胺类抗生素残留研究［J］.东北农业大学学报，2011，42（5）：31－35.

［5］姜 侃，陈宇鹏，金燕飞，等.应用酶联免疫法快速检测乳品中β－内酰胺类抗生素残留［J］.中国乳品工业，2010，38（1）：51－54.

［6］张 佳.放射受体分析法快速筛检动物组织中β－内酰胺类兽药残留［D］.福州：福建农林大学，2007.

［7］孙艳侠.高效液相色谱在乳品抗生素残留检测中的应用［J］.山西农业科学，2010，38（3）：10－13.

［8］谢恺舟，陈学森，徐 东，等.高效液相色谱荧光检测法检测鸡蛋中阿莫西林残留［J］.食品科学，2012，33（22）：264－268.

［9］孙 雷，张 俪，汪 霞，等.超高效液相色谱－串联质谱法对动物源性食品中13种β－内酰胺类药物残留的检测［J］.分析测试学报，2009，28（5）：576－580.

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（编 辑：侯向辉）

Detection of Illegally Added Amoxicillin and Ampicillin in 3 Kinds of Traditional Chinese Medicine for Animals by UPLC－MS／MS

QIAO Ying1，LIU Xue－hong1，DONG Hong－yang2，HOU Ying1，WANG Chi1，LI Juan1，ZHANG Yi－duo1
（1.Dalian Institute Veterinary Drug and Feedstuffs Control，Dalian，Liaoning116037，China；2.Dalian Shahekou District Food and Drug Inspection Institute，Dalian，Liaoning116021，China）

A method based on ultra－performance liquid chromatography tandem mass spectrometry（UPLC－MS／MS）was developed for the determination of amoxicillin and ampicillin illegally added in 3 kinds of traditional Chinese medicine for animals.Samples were extracted by 50%acetonitrile solution and diluted.The analyte was separated by Atlantis T3 column with a linear gradient elution program of 0.2%formic acid acetonitrile and 0.2% formic acid aqueous solution.Multiple reaction monitoring was used for the selective detection.The results demonstrated that the linearity range of amoxicillin and ampicillin were 1～50 ng／mL，and the limit of detection was 0.5 mg／g and 0.2 mg／g，respectively.The recovery was 83.4%～95.8%withRSDof 2.0%～4.6%for amoxicillin，and the recovery was 85.1%～97.2%withRSDof 1.7%～4.0%for ampicillin.It indicated that the method was accurate and reliable for determination of amoxicillin and ampicillin illegally added in 3 kinds of traditional Chinese medicine for animals.

traditional Chinese medicine for animals；amoxicillin；ampicillin；UPLC－MS／MS

2015－01－19

A

1002－1280（2015）04－0030－05

S859.83

乔 颖，硕士研究生，从事兽药及兽药残留检测工作。E－mail：qiaoyingwd＠163.com