八种蒙药制剂微生物限度检查方法验证

闹闹尔再

(新疆巴音郭楞蒙古自治州食品药品检验所，新疆 库尔勒 841000)



八种蒙药制剂微生物限度检查方法验证

闹闹尔再

(新疆巴音郭楞蒙古自治州食品药品检验所，新疆 库尔勒 841000)

目的：利用验证试验，为8种蒙药制剂制定微生物限度检查方法。方法：采用常规法和培养基稀释法对5株阳性菌进行回收率试验，确定8种蒙药制剂是否含抑菌成分。结果：根据回收率试验结果，8种蒙药制剂试验菌的回收率均达到70.0%以上，符合验证要求。结论：经验证的方法有效去除了8种蒙药制剂的抑菌成分，可用于制剂的质量控制。

蒙药制剂；微生物限度检查；验证试验

表5 三七皂苷R1对SW620结肠癌细胞存活的影响

组别药品浓度(μg·mL-1)吸收值抑制率(%)空白对照--0.801±0.0380100.00.607±0.023**24.1三七皂苷R150.00.597±0.029**25.425.00.565±0.034**29.312.50.648±0.052**18.9

注：与空白对照组比较*P<0.05，**P<0.01。

表6 大黄素、芦荟大黄素对SW620结肠癌细胞存活的影响

组别药品浓度(μg·mL-1)吸收值抑制率(%)空白对照--0.866±0.0330100.00.474±0.020**45.3大黄素50.00.486±0.034**43.925.00.788±0.074**9.012.50.871±0.0220100.00.262±0.012**69.7芦荟大黄素50.00.283±0.021**67.325.00.361±0.035**58.312.50.567±0.057**34.4

注：与空白对照组比较*P<0.05，**P<0.01。

表7 大黄酸对SW620结肠癌细胞存活的影响

组别药品浓度(μg·mL-1)吸收值抑制率(%)空白对照--0.837±0.0270100.00.537±0.047**35.8大黄酸50.00.606±0.027**27.625.00.624±0.015**25.512.50.639±0.033**23.6

注：与空白对照组比较*P<0.05，**P<0.01。

1 仪器与材料

1.1 仪器(见表1)

表1 仪器

1.2 供试品

调元大补二十五味丸、沉香八味散、消食十味散、枫香脂十味散、白葡萄七味散、杜鹃十六味散、檀香清肺八味散、小儿清肺八味散等,均来自新疆巴音郭楞蒙古自治州第二人民医院。

1.3 培养基、稀释剂及试液(见表2)

表2 培养基、稀释剂及试液

1.4 试验用菌种(见表3)

表3 实验用菌种

实验用菌种来自中国食品药品检定研究院。

2 方法学验证与结果

2.1 菌液制备方法

分别取适量枯草芽孢杆菌、乙型副伤寒沙门菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌标准菌株转移至10mL灭菌后的营养肉汤中，37℃恒温培养18～24h；取白色念珠菌适量，接种于改良马丁培养基中，在25℃下恒温培养24～48h。分别取1mL上述培养物，分别置于盛有9mL无菌生理盐水溶液的试管中，使其为10-5～10-7的菌悬液[1]。

将黑曲霉转移在改良马丁琼脂培养基上，25℃培养7天，用3mL无菌生理盐水洗脱孢子，取1mL加入9mL无菌生理盐水溶液中，使其为10-5～10-7的孢子悬液[1]。

2.2 供试液制备

取样品10g，置锥形瓶中，加无菌NaCl-蛋白胨缓冲液(pH7.0)至100mL，2 000r/min振摇10min，即得。

2.3 细菌、霉菌及酵母菌检查方法验证[1]

2.3.1 平皿法 取“2.2”项下供试液(1∶10)1mL，及“2.1”中的验证用试验菌，分别注入平皿中，按规定培养并测回收率；平行做菌液组、稀释剂对照组和供试品对照组[2]。结果见表4。

2.3.2 培养基稀释法 取0.2mL“2.2”项下供试液/皿，加入验证菌各10-5～10-7，按照“2.3.1”项下方法进行试验。结果见表5。

2.4 控制菌检查方法的验证[1]

2.4.1 大肠埃希菌 取供试液(1∶10)10mL及1mL 10-5～10-7大肠埃希菌，注入100mL胆盐乳糖培养基(BL)中，于37℃下培养24h，观察培养基澄清度的变化；之后取浑浊管中的培养物适量做荧光反应与靛基质试验。另取适量的培养物划线接种于MacC平板上，37℃培养24h，观察其菌落的生长形态特征[2]。同时以金黄色葡萄球菌代替大肠埃希菌，照上述方法进行试验。结果见表6。

表4 平皿法接种阳性对照菌回收率试验结果 (%)

表5 培养基稀释法(0.2mL/皿)接种阳性对照菌回收率试验结果 (%)

表6 大肠埃希菌检查法验证

2.4.2 大肠菌群 取供试液(1∶10)1mL及10-5～10-7大肠埃希菌转移至9mL乳糖胆盐发酵培养基中，37℃培养24h，取适量发酵管中的培养物划线接种于MacC平板上，37℃培养18～24h，观察其菌落的生长形态特征[1]。同时将大肠埃希菌金换成黄色葡萄球菌，按上述方法进行试验。结果见表7。

表7 大肠菌群检查法验证

2.4.3 沙门菌 取供试品10g，加200mL的无菌营养肉汤培养基，2 000r/min，5min混匀，加入预先制备好的沙门菌悬液1mL，培养18～24h，取培养物1mL，接种于10mL TTB中培养18～24h。同时取金黄色葡萄球菌代替沙门菌，同上述方法进行试验。结果见表8。

3 讨论

微生物限度检查是药品安全性检查的重要项目。由于蒙药制剂是含有多种成分的复方制剂，其成分种类繁多复杂，处方中任一成分均有可能具有抑菌活性，大多数蒙药还含有生药原粉或动物药，可影响蒙药制剂微生物限度检查的准确性，因此需按规定进行大肠菌群、沙门菌检查方法验证。

从表1中结果可以看出，通过平皿法验证，白葡萄七味散、杜鹃十六味散、消食十味散、檀香清肺八味散、调元大补二十五味丸等5种药品用常规平皿法验证，可使5株试验菌的回收率均达到70.0%以上，提示以上5种药品没有抗菌作用。枫香脂十味散平皿法回收率试验显示，采用平皿法可完全回收白色念珠菌、黑曲霉菌和大肠埃希菌，但金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的回收率很低，分别为6.0%、0%；表明这两株菌的生长几乎完全被抑制，药物有明显的抑菌作用。沉香八味散、小儿清肺八味散等2种药品除了枯草芽孢杆菌外，其他4株菌的回收率超过70%，而枯草芽孢杆菌无法回收，回收率分别为0%、25.0%，药物有明显的抑菌作用。以上结果表明枫香脂十味散、沉香八味散、小儿清肺八味散等3种药品含抑菌成分，必须采用适当的方法去除抗菌活性，重新进行菌落计数方法的验证。

从表2中可以看出，为了消除蒙药制剂中的抑菌成分，本次实验采用了培养基稀释法，实验结果表明每皿0.2mL可消除抑菌成分对细菌生长的影响。沉香八味散、枫香脂十味散、小儿清肺八味散等3种药品的阳性对照菌的回收率均达到70.0%以上，基本消除抑菌活性。因此培养基稀释法(每皿0.2mL)可用于以上3种蒙药制剂的细菌数检查。

从表3至表5可以看出，以上8种蒙药制剂对控制菌(大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌)无抑制作用，控制菌检查可采用常规法。

4 结语

调元大补二十五味丸、消食十味散、白葡萄七味散、杜鹃十六味散和檀香清肺八味散按平皿法进行细菌数检查；沉香八味散、枫香脂十味散、小儿清肺八味散采用培养基稀释法(每皿0.2mL)进行细菌数检查；本试验中8种药品的霉菌和酵母菌菌落数须用平皿法进行检查，而控制菌的检查按常规法即可。本次试验结果可供药品检验部门参考。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京:人民卫生出版社,2010:附录79-88.

[2] 中华人民共和国卫生部药典委员会.卫生部药品标准·蒙药分册[S].1997.

(责任编辑：尹晨茹)

2015-01-30

闹闹尔再(1974-)，女，蒙古族，新疆巴音郭楞蒙古自治州食品药品检验所副主任药师，研究方向为食品药品检验。

R446.5;R915

A

1673-2197(2015)12-0014-03

10.11954/ytctyy.201512006

蒙医药学是我国甚至世界传统医药学的重要组成部分；蒙医药历史悠久，疗效确切，作用缓和，在民间被广泛应用。调元大补二十五味丸、沉香八味散、消食十味散、枫香脂十味散、白葡萄七味散、杜鹃十六味散、檀香清肺八味散、