小花棘豆中毒对家兔脑组织α-甘露糖苷酶的影响

贾琦珍 王 帅 张 玲 郭 武 陈根元

(1 塔里木大学生命科学学院， 新疆 阿拉尔 843300)(2 新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室， 新疆 阿拉尔 843300)(3 塔里木大学动物科学学院， 新疆 阿拉尔 843300)



小花棘豆中毒对家兔脑组织α-甘露糖苷酶的影响

贾琦珍1,2王 帅2,3张 玲2,3郭 武3陈根元2*

(1 塔里木大学生命科学学院， 新疆 阿拉尔 843300)(2 新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室， 新疆 阿拉尔 843300)(3 塔里木大学动物科学学院， 新疆 阿拉尔 843300)

探讨小花棘豆对家兔脑组织α-甘露糖苷酶(AMA)的影响，进一步揭示小花棘豆的毒性作用机理。将24只家兔随机分为4组，即对照组和试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组。将小花棘豆全草粉碎后，按试验Ⅰ组添加15%，试验Ⅱ组添加30%，试验Ⅲ组添加45%的比例制作混合饲料，饲喂至典型临床症状出现为止。攻毒后第14、35、70d每次每组随机采集2只家兔的全脑，检测家兔不同脑区AMA活性及表达的变化。结果显示，小花棘豆中毒可不同程度地导致家兔脑组织AMA活性和表达下降，从第14d起，所有试验组小脑AMA活性及mRNA表达量均显著低于对照组(P﹤0.05)，试验Ⅲ组家兔大脑和丘脑AMA活性及mRNA表达量均显著低于对照组(P﹤0. 05)，但3个试验组海马和脑干AMA活性及mRNA表达量与对照差异均不显著(P﹥0. 05)。结果表明，不同剂量小花棘豆均可降低家兔脑组织AMA活性及其mRNA表达量，小脑、大脑和丘脑是其主要作用的靶区，而且小脑的变化较大脑和丘脑明显。

小花棘豆；α-甘露糖苷酶； 中毒； 家兔

小花棘豆(OxytropisglabraDC)广泛分布于新疆和田、阿克苏等地区，据不完全统计，仅阿克苏地区的271.97万hm2天然草场中广泛丛生小花棘豆的面积已超过40万hm2，每年因采食小花棘豆而中毒的家畜占放牧家畜总数的5%～10%，中毒动物表现为机体的广泛性损伤，其中尤以神经系统损伤最为明显[1]。小花棘豆具有根系发达，繁殖系数高，耐旱，耐贫瘠，返青早，多种籽，生命力强等特性，现已严重危害新疆草原畜牧业的发展[2]。针对于此，课题组成员对动物小花棘豆中毒的病理学等进行了研究，发现小花棘豆中毒可导致动物抗氧化机能[3，4]，血液生理生化指标[5-7]等异常变化。研究表明α-甘露糖苷酶(AMA)是动物小花棘豆中毒特异性最强的指标[8]，小花棘豆中毒动物的AMA活性受到显著抑制，但对其转录、翻译、加工修饰等的影响尚不清楚。本试验通过ELISA和荧光实时定量PCR法，以新疆南疆地区小花棘豆为毒源，研究小花棘豆攻毒对家兔脑组织AMA活性和mRNA表达量的影响，为小花棘豆中毒机制的研究提供基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料、试剂与仪器

小花棘豆由塔里木大学动物科学学院草业科学学科组提供，采自新疆和田市策勒县恰哈乡，样品为风干样。

AMA检测试剂盒，南京建成生物技术有限公司；总RNA提取试剂Trizol，反转录试剂盒，PCR扩增试剂盒Hot-startPCRMix，实时荧光定量PCR试剂盒SYBRGreenIPCRMix，均为美国Thermo；其余试剂均为国产分析纯，实验室用水为超纯水。

PCR仪(Eppendorf公司5331)，电泳仪(北京六一DYY-Ⅱ)，组织匀浆仪(ProScientific公司PRO250)，凝胶成像分析仪(UVP公司GELDOC-IT)，实时荧光定量PCR仪(Eppendorf公司Realplex2)，紫外-可见分光光度计(Varian公司Carry100)。

1.2 试验动物分组与处理

家兔24只，雌雄各半，体重(2.0±0.1kg)，购自塔里木大学动物科学学院实验站。随机分为对照组，试验Ⅰ组、试验Ⅱ组和试验Ⅲ组，每组6只。分笼饲养，自由采食和饮水。对照组饲喂青干草，试验Ⅰ组、试验Ⅱ组和试验Ⅲ组分别饲喂含有小花棘豆15%、30%和45%的混合干草。试验持续70d。在攻毒后第14、35和70d每组随机取2只家兔，剖杀后取全脑组织，在冰面上迅速分取双侧大脑皮层、小脑、丘脑、脑干和海马，部分置于0.32mol/L蔗糖缓冲液(1/10，W/V)中匀浆10min，2 500r/min离心15min后制备10%组织匀浆液用于检测AMA活性，AMA活性检测采用间接ELISA法；部分组织液氮保存用于检测mRNA水平表达的影响。所有解剖工具及冻存管均预先用DEPC水处理。

1.3 小花棘豆中毒家兔脑组织AMA在mRNA表达水平的测定

1.3.1 引物设计与合成

根据GenBank中家兔AMA及β-actin基因的核苷酸序列，采用BeaconDesigner软件设计引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物信息表见表1。

1.3.2 总RNA提取与cDNA合成

根据Trizol法操作方法提取家兔不同脑组织总RNA，然后用核酸蛋白检测仪测定其OD260和RNA浓度，用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。确认提取的RNA合格后采用反转录试剂盒进行反转录反应。反转录反应体系见表2。其反应程序为：95 ℃预变性3min， 94 ℃变性30s，55 ℃退火30s，72 ℃延伸30s，反应40个循环，72 ℃最终延伸10min。

表1 引物设计

表2 反转录反应体系

1.3.3 普通PCR及基因测序

PCR反应体系见表3。其反应程序为：95 ℃预变性5min， 94 ℃变性20s，58 ℃退火30s，72 ℃延伸30s，反应30个循环，72 ℃最终延伸10min[7]。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.3.4 实时荧光定量PCR检测家兔脑组织中AMA的相对表达

实时荧光定量PCR反应体系见表4。其反应程序为：95 ℃预变性3min， 94 ℃变性30s，58 ℃退火30s，72 ℃延伸30s，反应35～40个循环，72 ℃最终延伸10min。

1.4 数据分析

试验数据使用SPSS16.0软件中One-WayANOVA方法进行单因素方差分析。

表3 PCR反应体系

表4 实时荧光定量PCR反应体系

2 结果与分析

2.1 引物的可靠性验证

由图1可知，β-actin在200bp下方出现175bp左右的条带，AMA基因在300bp下方出现258bp左右的条带，与试验设计的目的条带大小相符，表明引物设计良好。

图1 引物PCR电泳图

2.2 家兔不同脑区AMA活性的变化

由表5可知，攻毒第14d时各试验组家兔小脑AMA活性与对照组差异均显著低于对照组(P﹤0.05)；试验Ⅲ组家兔大脑和丘脑AMA活性均显著低于对照组(P﹤0.05)，但试验Ⅰ组和试验Ⅱ组大脑和丘脑AMA活性与对照家兔差异不显著(P﹥0.05)。各试验组家兔临床表现为被毛失去光泽，但均未见典型中毒症状。攻毒第35d时各试验组家兔小脑AMA活性均极显著低于对照组(P﹤0.01)；试验Ⅰ组家兔大脑和丘脑AMA活性显著低于对照(P<0.05)，试验Ⅱ组和试验Ⅲ组家兔大脑和丘脑AMA活性均极显著低于对照组(P﹤0.01)，期间攻毒家兔出现行动困难、喜卧等症状，其中试验Ⅲ组尤为明显。攻毒第70d时所有试验组家兔小脑和丘脑AMA活性均极显著低于对照组(P﹤0.01)，除试验Ⅰ组外其余试验组大脑AMA活性均极显著低于对照组(P﹤0.01)。中毒家兔头部出现神经性震颤，对外界反应迟钝，运动协调性下降，试验Ⅲ组家兔出现死亡。但整个试验期内所有试验家兔海马和脑干AMA活性差异不显著(P﹥0.05)。

2.3 家兔小花棘豆中毒对AMA在mRNA水平表达的影响

由表6可知，AMAmRNA在不同脑组织间表达差异不同。与对照组相比，第14d时试验Ⅰ组、试验Ⅱ组和试验Ⅲ组家兔小脑中AMAmRNA表达量分别下降了34.8%、38.8%和44.9%，均与对照组差异显著(P﹤0.05)；试验Ⅰ组和试验Ⅱ组大脑、丘脑中AMAmRNA表达量均呈下降趋势，但与对照组差异不显著(P﹥0.05)，试验Ⅲ组家兔大脑、丘脑中AMAmRNA表达量与对照相比分别下降了40.6%和44.4%，与对照组差异显著(P﹤0.05)。第35d时各试验组家兔小脑AMAmRNA表达量与对照相比分别下降了40.3%、52.5%和65.2%，其中试验Ⅱ组和试验Ⅲ组均极显著低于对照组(P﹤0.01)；试验Ⅰ组家兔大脑和丘脑AMAmRNA表达量显著低于对照(P<0.05)，试验Ⅱ组和试验Ⅲ组家兔大脑和丘脑AMAmRNA表达量均极显著低于对照组(P﹤0.01)。攻毒第70d时所有试验组家兔小脑和丘脑AMAmRNA表达量均极显著低于对照组(P﹤0.01)。但整个试验期内所有试验家兔海马和脑干AMAmRNA表达量未见明显变化。表明小花棘豆中毒可抑制家兔大脑、小脑及丘脑中AMA在mRNA水平的表达，并呈现出明显的时间-剂量效应。小花棘豆毒性成分作用的主要靶区为小脑、丘脑和大脑。

3 讨论

苦马豆素是小花棘豆的主要毒性成分，学名为1,2,8-三羟基八氢吲哚里西啶，其半椅状结构与甘露糖类似，可强烈的、特异性的与AMA结合，从而使机体甘露糖代谢发生异常，导致甘露糖大量蓄积于细胞内而造成细胞空泡变性，最终导致细胞损伤[9]。AMA在机体糖蛋白合成和代谢方面具有重要的作用，细胞中蛋白质合成后需要经过加工、修饰后方可发挥生物活性。AMA在N-糖基化过程中对甘露糖进行加工，该过程与蛋白的折叠、运输、成熟、构象维持、半衰期及生物活性密切相关。AMA既是N-聚糖成熟的必要酶，也参与N-聚糖的降解[10，11]。试验表明，小花棘豆中毒家兔大脑、小脑和丘脑等部位AMA活性显著下降，其结果与荣杰[12]的报道一致，证明小花棘豆毒性成分可通过影响AMA导致动物中毒。

表5 家兔试验期内不同脑区AMA活性的变化(nmol·S-1·L-1)

注：同列数据小写字母不同表示差异显著(P<0.05)，大写字母不同表示差异极显著(P<0.01)，下同。

表6 AMA mRNA在家兔不同脑区相对表达情况

小花棘豆中毒可导致动物细胞空泡变性，镜检可见中毒动物大脑出现普遍性神经元肿胀，小脑萎缩，蒲肯野细胞和颗粒细胞丧失[1]，表明小花棘豆中毒可显著影响动物神经系统。前期研究表明小花棘豆中毒可抑制AMA活性，但对其转录、翻译、加工修饰等的影响研究较少。张建军等[13]研究发现小花棘豆中毒可显著影响小鼠肝脏组织内AMA的相对表达，其中高剂量组可显著降低肝脏组织内的AMA基因相对表达。本试验研究发现，小花棘豆毒性成分可显著影响小脑、大脑及丘脑的AMA在mRNA水平的表达，表明小花棘豆毒性成分可从mRNA水平影响AMA的表达，从而为揭示小花棘豆中毒的作用机理奠定了基础。

AMA活性受到抑制可导致细胞内糖蛋白的N-糖基化合成、加工、转运等过程发生变化，临床上表现为生殖功能、内分泌和免疫功能紊乱[14，15]。试验表明AMA在不同脑区活性与表达水平差异显著，其中小脑、大脑和丘脑的表达水平显著高于海马、脑干，小花棘豆中毒对AMA的抑制作用也主要作用于小脑、大脑和丘脑。从本试验结果来看，小花棘豆中毒可导致家兔大脑、小脑及丘脑AMA活性与表达水平显著下降，而且下降趋势与小花棘豆摄入量呈现极显著的正相关。这种变化趋势与家兔行为学变化之间也呈现出明显的对应性。综上可以得出上述三部分脑区可能是小花棘豆毒性物质的作用靶区。

[1] 王帅,贾琦珍,胡建军,等.小鼠实验性小花棘豆中毒的病理学观察[J]. 塔里木大学学报, 2014,26(2):11-15.

[2] 王帅,张玲,陈根元,等.小花棘豆生态学研究概况[J]. 家畜生态学报, 2014,35(3):85-88.

[3] 王帅,张玲,陈根元,等.苦马豆素对家兔肝脏抗氧化功能的影响[J]. 塔里木大学学报, 2012,24(2):1-6.

[4] 王帅,陈根元,张玲,等.小花棘豆对家兔脑组织抗氧化功能的影响[J].中国兽医学报,2013, 33(8):1272-1277.

[5] 王帅,陈根元,张玲,等.小花棘豆对家兔血液生化指标的影响[J].中国兽医科学,2013, 43(2):190-196.

[6] 王帅,陈根元,张玲,等.小花棘豆中毒对家兔血常规参数的影响[J].西南农业学报,2013, 26(4):1682-1690.

[7] 王帅,胡建军,陈根元,等.小花棘豆对家兔血清蛋白的影响[J].江苏农业科学,2014, 42(1):164-166.

[8] 贾琦珍,陈根元,胡建军,等.家兔小花棘豆中毒与血液生化指标的相关性研究[J].新疆农业科学,2013, 50(11):2125-2129.

[9] 王帅,吴书奇,陈根元,等.α-甘露糖苷酶法测定家兔血清中苦马豆素含量[J]. 中国草食动物,2012, 32(1):42-44.

[10]Kuntezda,Nakayamas,Sheak,etal.StrueturalInvestigationoftheBindingof5-SubstitutedSwainsonineAnaloguestoGolgiα-MannosidaseⅡ[J].ChemBioChem,2010,11(5):673-680.

[11]OrcianiaM,TrubianiO,VigniniA,etal.Nitricoxideproductionduringtheosteogenicdifferentiationofhumanperiodontalligamentmesenchymalstemcells[J].ActaHistochemica, 2009,111(1):15-24.

[12] 荣杰. 甘肃棘豆对大鼠亚急性毒性及α-甘露糖苷酶发布与表达的影响[D].陕西杨凌:西北农林科技大学,2011.

[13] 张建军,韩敏,王宇,等. 小花棘豆苦马豆素对小白鼠肝脏α-甘露糖苷酶基因相对表达的影响[J]. 中国畜牧兽医, 2014,41(2):50-53.

[14]YbarraN,delCastilloJRE,TroncyE.Involvementofthenitricoxide-solubleguanylylcyclasepathwayintheoxytocin-mediateddifferentiationofporcinebonemarrowstemcellsintocardiomy-ocytes[J].NitricOxide,2011,24(1):25-33.

[15]PolakovaM,SestakS,LattovaE,etal.α-D-mannosederivativesasmodelsdesignedforselectiveinhibitionofGolgiα-mannosidase[J].JVetDiagnInvest,2011,23(2):221-232.

OxytropisglabraDCPoisoningEffectsonα-mannosidaseinRabbitBrain

Jia Qizhen1,2Wang Shuai2,3Zhang Ling2,3Guo Wu3Chen Genyuan2 *

(1 College of Life Science, Tarim University, Alar, XinJiang 843300)

(2 Key laboratory of Tarim Animal Husbandry Science and Technology, XinJiang Production & Construction Corps, Alar, XinJiang 843300)

(3 College of Animal Science, Tarim University, Alar, XinJiang 843300)

To studyOxytropisglabraDConrabbitbraintissueα-mannosidase(AMA)effect,andfurtherrevealthemechanismofthetoxicityofO.glabraDC,24rabbitswererandomlyandequallydividedinto4groups(thecontrolgroupandexperimentalgroupⅠ,Ⅱ,Ⅲ).ThedriedplantofO.glabraDCwascomminnuted,anddifferentamountsofthegrasspowder(15%,30%and45%)weremixedwiththefeedsinthethreeexperimentalgroups.Therabbitsconsumedtheforagesfreelyuntiltypicalsymptomswereobserved. 2rabbitswereselectedrandomlyfromeachgrouponthe14th, 35thand70thdayrespectively,thebrainwascollectedandthecontentsofAMAanditsmRNAexpressionindifferentencephalicregionsweremeasured.TheresultsdemonstratedthatO.glabraDCinhibitedthecontentandexpressionofAMA,thecontentofAMAandtheexpressionofAMAmRNAincerebelluminallexperimentalgroupsweresignificantlylowerthannormalcontrolgroupfrom14thday(P﹤0.05),thecontentofAMAandtheexpressionofAMAmRNAincerebrumandthalamusinexperimentalgroupⅢweresignificantlylowerthannormalcontrolgroup(P﹤0. 05),butthedifferenceofthecontentofAMAandtheexpressionofAMAmRNAwerenotobviousinbrainstemandhippocampus(P﹥0. 05).TheresultsshowedthatO.glabraDChasremarkableeffectsonthecontentsofAMAofbraininrabbits.ItisindicatedthatthreeregionsweretheeffecttargetsitesofO.glabraDCinthebraintissue,weconcludedthatO.glabraDCcouldproducepoisoningeffectbypromotingcerebellum,cerebrumandthalamus.

OxytropisglabraDC;α-mannosidase;poisoning;rabbit

2014-06-03

新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室开放课题(HS201409)

贾琦珍(1984-)，女，硕士，研究方向为动物中毒病。E-mail:xiaxue1984521@126.com

*为通讯作者E-mail:cgygood207@163.com。

1009-0568(2014)01-0018-06

S

ADOI：10.3969/j.issn.1009-0568.2015.01.003