5种中药材提取物对黄嘌呤氧化酶的抑制作用

张 雪，周 英，管 静，鄢守群，俸婷婷*

(1.贵州大学药学院，贵州 贵阳 550025;2.贵州省中药民族药创制工程中心，贵州 贵阳 550025;3.贵州省药食同源植物资源研究开发中心，贵州 贵阳 550025)

黄嘌呤氧化酶(Xanthine oxialse，XOD)是一种黄素蛋白酶，主要分布于肝脏和肾脏。黄嘌呤氧化酶既能催化黄嘌呤生成次黄嘌呤，也能催化次黄嘌呤生成尿酸，因此，当人体摄入嘌呤类食物过多，或黄嘌呤氧化酶活性增强，嘌呤代谢紊乱时，体内尿酸浓度就会升高，形成高尿酸血症。尿酸浓度过高，易在关节处沉积形成结晶造成痛风。因此，抑制黄嘌呤氧化酶的活性是减少尿酸的产生，治疗痛风的关键。别嘌呤醇是典型的黄嘌呤氧化酶抑制剂，是目前治疗痛风的首选药。本实验在体外直接测定了中药材提取物对黄嘌呤氧化酶的抑制作用，筛选出对黄嘌呤氧化酶具有较好抑制作用的中药材，以期为相关中药材的应用及药效物质的进一步研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料及仪器

黄嘌呤氧化酶(Sigma)，别嘌呤醇(Ruibio)，黄嘌呤氧化酶试剂盒(南京建成生物工程研究所)，吴茱萸、大血藤(四平市百草堂中药饮片有限公司)，老鹳草(湖北金贵中药饮片有限公司)，木瓜(成都市益诚药业有限公司)，锁阳(四川弘升药业有限公司);旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器)，冷冻干燥机(北京松源华兴科技)，酶标仪(Thermo)。

1.2 中药材提取物的制备

水提取物的制备称取中药材100.0 g粉碎成粗粉，料液比1∶10，二次蒸馏水80℃回流提取，连续提取三次，时间分别为3 h，2 h，1 h，过滤，合并滤液，浓缩，冷冻减压干燥，即得水溶性组分，密封干燥保存。

乙醇提取物的制备 称取中药材100.0 g粉碎成粗粉，料液比1∶10，75%的乙醇30℃回流提取，连续提取三次，时间分别为3 h，2 h，1 h，过滤，合并滤液，浓缩，冷冻减压干燥，得醇溶性组分，密封干燥保存。

1.3 黄嘌呤氧化酶活性的测定

黄嘌呤氧化酶溶液的配制 在无菌超净台中，冰盒上操作，将5 U(500μL)黄嘌呤氧化酶用7264 μL KH2PO4(50mmol/L)缓冲液溶解，混匀，即得6.44×104U/μL，分装，－20℃保存备用。

黄嘌呤氧化酶活性(全酶活性)采用紫外分光光度法进行测定，使用黄嘌呤氧化酶试剂盒进行实验。实验设置空白组、实验组，实验组加入25 μLPBS及25μL黄嘌呤氧化酶溶液，空白组以等体积PBS代替黄嘌呤氧化酶，直接加入50μLPBS，按照试剂盒操作依次加入试剂一至试剂四，混匀，37℃避光反应20 min，加入1 mL终止反应液，混匀，530 nm处测定吸光度(OD值)，平行操作三次，以平均值作为最后结果。

1.4 别嘌呤醇及中药材提取物对黄嘌呤氧化酶抑制作用的测定

精密称取4.0 mg别嘌呤醇溶于1 mL DMSO中，充分混匀，磷酸盐缓冲液(PBS)梯度稀释为0.4、0.2、0.1、0.05、0.025mg/mL，备用。

精密称取10.0 mg中药材水提取物溶于0.5 mL PBS中，充分混匀，PBS梯度稀释成不同浓度，备用。精密称取10.0mg中药材乙醇提取物溶于，0.5mL DMSO中，充分混匀，PBS梯度稀释成不同浓度，备用。

别嘌呤醇及中药材提取物对黄嘌呤氧化酶活性的抑制作用采用黄嘌呤氧化酶试剂盒进行测定。实验设置空白组、实验组，实验组加入25μL样品溶液及25μL黄嘌呤氧化酶溶液，空白组以等体积PBS代替黄嘌呤氧化酶，加入25μL样品溶液及25 μLPBS，按照试剂盒操作依次加入试剂一至试剂四，混匀，37℃避光反应20 min，加入1 mL终止反应液，混匀，530 nm处测定吸光度(OD值)，平行操作三次，以平均值作为最后结果。

全酶活性为实验组的OD值与空白组的OD值之差，即A实验组－A空白组。别嘌呤醇能够抑制黄嘌呤氧化酶的活性，在实验组中加入别嘌呤醇，测定不同浓度的别嘌呤醇作用黄嘌呤氧化酶后生成的紫色产物的OD值，减去空白组OD值作为最后结果，即B实验组－B空白组。抑制率(%)的计算见公式。采用SPSS19.0计算半数抑制浓度IC50。

2 结果与分析

2.1 黄嘌呤氧化酶活性及别嘌呤醇的抑制作用

黄嘌呤氧化酶在催化次黄嘌呤生成黄嘌呤的过程中会产生超氧自由基，超氧自由基与电子受体作用，在显色剂存在时形成紫色化合物，通过测定紫色化合物吸光度的大小可间接反应黄嘌呤氧化酶的活性。紫色化合物吸光度越大，酶活性越强。不同浓度的别嘌呤醇对黄嘌呤氧化酶抑制作用结果见表1，其半数抑制浓度IC50为0.112mg/mL。

表1 别嘌呤醇对黄嘌呤氧化酶的抑制作用结果Tab.1 Xanthine oxidase inhibitory activity of allopurinol

2.2 中药材提取物对黄嘌呤氧化酶抑制作用

中药材提取物对黄嘌呤氧化酶的抑制作用亦是通过测定加入中药材提取物后，反应体系生成的紫色产物的OD值，减去空白组OD值作为最后结果，即B实验组－ B空白组。抑制率(%)按照公式(1)进行计算，采用SPSS19.0计算半数抑制浓度IC50，结果见表2。5种中药材的醇提物和水提物(20mg/mL)的抑制率均大于50%，其中老鹳草的水提物及醇提物的抑制率最高，分别为90.95%、94.64%。老鹳草的醇提物及水提物对黄嘌呤氧化酶的半数抑制浓度 IC50最小，分别为 3.141 mg/mL、2.407 mg/mL。其次，大血藤醇提物与水提物对黄嘌呤氧化酶的抑制作用也比较明显，其IC50分别为7.177 mg/mL、9.120mg/mL。

5种中药材提取物对黄嘌呤氧化酶抑制作用均呈浓度依赖性，提取浓度越大，抑制作用越强。比较5种中药材的水提物与醇提物对黄嘌呤氧化酶的的半数抑制浓度IC50，除老鹳草外，其余4种中药材的醇提物的IC50均小于水提物的IC50。

3 讨论

本实验中阳性对照别嘌呤醇对黄嘌呤氧化酶的半数抑制浓度IC50为0.112 mg/mL，5种中药材的提取物对黄嘌呤氧化酶均具有一定的抑制作用，5种中药材的提取物(20 mg/mL)对黄嘌呤氧化酶的抑制率均大于50%。其中，老鹳草的水提物和醇提物对黄嘌呤氧化酶的抑制作用最明显，其IC50分别为2.4070 mg/mL、3.1409 mg/mL。大血藤、锁阳、吴茱萸、木瓜的乙醇提取物和大血藤的水提取物，对黄嘌呤氧化酶均具较明显的抑制作用，其IC50值分别为 7.177 mg/mL、7.351 mg/mL、10.203 mg/mL、8.249mg/mL、9.120 mg/mL。对 5 种中药材醇提物和水提物的抑制作用进行比较，除老鹳草外，4种中药材的醇提物的IC50均小于水提物的IC50，这对进一步研究该类中药材对黄嘌呤氧化酶的抑制作用的药效物质具有一定的参考价值。

表2 中药材提取物对黄嘌呤氧化酶的抑制作用结果(n=3) Tab.2 Xanthine oxidase inhibitory activity of extracts obtaubed from Chinese herbalmedicines(n=3)

别嘌呤醇作为首选黄嘌呤氧化酶抑制剂，其作用机制是由于别嘌呤醇在黄嘌呤氧化酶的作用下生产别黄嘌呤，别黄嘌呤对黄嘌呤氧化酶的亲和力大于黄嘌呤及次黄嘌呤，能够竞争性抑制黄嘌呤氧化酶的作用，进而抑制尿酸的产生。此外，黄嘌呤、次黄嘌呤的溶解度高于尿酸，更易随尿液排出体外，间接降低了血液中的尿酸量。当血尿酸浓度低于尿酸的溶解度，可促进关节处的尿酸结晶的溶解，以达到治疗痛风的作用。但别嘌呤醇在用药过程存在一系列的毒副作用，如白细胞及血小板减少、过敏、腹痛，长期使用甚至会诱发中毒性肝炎［1］。因此，寻找安全、能够有效抑制黄嘌呤氧化酶的中药材一直是研究的热点。中药材中具有大量能够有效抑制黄嘌呤氧化酶的活性成分，谭明亮等［2］总结了天然植物中具有黄嘌呤氧化酶抑制作用的中药提取物，活性部位及单体等物质。Cos等［3］综述了黄酮类化合物作为过氧化物的清除剂对黄嘌呤氧化酶抑制的抑制作用的构效关系，提示中药材中黄酮类化合物的黄嘌呤氧化酶抑制作用。此外，黄嘌呤氧化酶抑制剂的研究大多通过构建高尿酸血症动物模型进行体内筛选，实验周期长，成本高，实验干扰因素多;在体外进行黄嘌呤氧化酶抑制作用的研究，具有高效快速，药物作用靶点明确等优点，是筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂的优选方法［4］。

本试验中老鹳草、大血藤的提取物对黄嘌呤氧化酶的抑制作用均比较明显。老鹳草富含大量的黄酮类化合物，其主要具有祛风湿、止泻、通经络等药理作用［5］;大血藤中含有酚酸、木脂素等化合物，主要具有抑菌、抗过敏、抗氧化、及较好的心血管系统保护作用［6］，两者对黄嘌呤氧化酶的抑制作用尚未见报道。本实验仅初步探讨了几种中药材水提物及醇提物对黄嘌呤氧化酶的抑制作用，其具体作用机制及药效物质有待进一步深入研究。

［1］杨 媛，李 静，甄健存，等.抗痛风药别嘌呤醇、苯溴马隆及秋水仙碱不良反应报告分析［J］.中国医院药学杂志，2013，15:1296－1297.

［2］谭明亮，陈 刚.天然产物来源的黄嘌呤氧化酶抑制剂研究进展［J］.重庆工商大学学报(自然科学版)，2014，02:86－90.

［3］Cos P，Ying L，Calomme M，etal.Structure activity relationship and classification of fl－ avonoids as inhibitors of xanthine oxidase and superoxide scavengers［J］.Nat Prod，1998，61(1):71－ 76.

［4］张 雪，俸婷婷，黄俊飞，等.降尿酸药物筛选方法学研究进展［J］.亚太传统医药，2015，06:48－50.

［5］程小伟.老鹳草化学成分及其生物活性研究［D］.陕西科技大学，2014.

［6］赵秀梅，柯洪琴，于慧斌.大血藤药理作用与临床应用研究进展［J］.中医药导报，2014，11:41－43.