黔产杜仲叶的1H-NMR指纹图谱研究

黄 滔，董 芬，吴贵辉，陈 艳，顾 伟，张建新

(贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室，贵州 贵阳 550002)

杜仲(Eucommia ulmoides Oilv.)为杜仲科杜仲属植物，杜仲又名思仲、木棉、丝连皮等［1］。分布于陕西、甘肃、河南、湖北、四川、云南、贵州、湖南及浙江等省区，现各地广泛栽种［2］。杜仲是我国特有名贵树种，可作为药用、胶用、材用及用作保健饮料、饲料等的原料。杜仲作为药用始载于《神农本草经》，并列为药之上品，具有补中益气、强志、坚筋骨、久服轻身耐劳的功效。杜仲从开始种到剥皮一般需要10年左右，因此仅皮作为药源显的资源紧缺。杜仲的化学成分研究表明，杜仲叶的化学成分与杜仲皮基本一致［3，4］，许多专家和学者证明了杜仲的叶与皮有相似的药理作用［5-7］，以叶代皮的想法得到了进一步证实。现在杜仲叶已作为一种新药收入《中国药典》。本研究在前期对杜仲叶中化学成分分离纯化的基础上［8］，拟采用核磁共振波谱技术建立杜仲1H-NMR(Proton Nuclear Magnetic Resonance)指纹图谱，将为杜仲叶质量控制提供一种新方法。

1 材料与方法

1.1 仪器

INOVA 400 MHz核磁共振波谱仪(美国Varian公司)，谱仪控制软件VNMR 6.1C(美国Varian公司)，氘代二甲基亚砜(美国Cambridge Isotope La-boratories公司)，电子分析天平(德国 sartorius公司)，N-1100型旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司，5 mm核磁管(美国 Wilmad-LabGlass公司)。

1.2 供试样品溶液的制备

杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.)叶由贵阳中医学院付志明教授鉴定，采自贵阳市三江农场，对照品为绿原酸、槲皮素、紫云英苷、陆地锦苷、山萘酚(均为前期从杜仲叶中分离中得到)。称取杜仲叶粉末1.5 g，置50 mL圆底烧瓶中，加入65.0%乙醇溶液25 mL，加热回流1 h，减压旋转蒸干溶剂，称取10 mg浸膏置于5 mm核磁管中，加入0.6 mL DMSO-d6溶解，取得待测液，上机。

1.3 1H-NMR测定条件

以DMSO-d6为频率内锁，测定温度 T=25℃，操作频率399.9 MHz，脉冲序列 cpmgt2，谱宽sw=7 959 Hz，回波循环时间 d2=0.001 s，弛豫时间bt=0.1 s，采集时间at=3.744 s，脉冲延迟时间d1=10 s，采样参数为nt=128次，脉冲宽度为sw=7 959 Hz，取得1H-NMR FID数据。并利用对照品，采用“标准样品滴定”和JRES(J-Resolved)二维核磁共振波谱实验得到的数据，鉴定从黔产杜仲叶总体取物的物质。

1.4 数据处理

将测得的1H-NMR FID数据导入MestReNova软件，线性加宽因子lb=1 Hz，进行傅立叶转换，并手动调整相位和基线，对0.5～12 ppm范围内的谱图以0.04 ppm为单位进行分段积分，并以总面积进行归一化处理，然后以ASCII格式输出数据导入Excel软件中进行夹角余弦计算［9-10］，得到夹角余弦值。

1.5 重复性实验

取同一批药材粉末5份，每份2 g，按上供试样品溶液的制备进行处理，再按得到5组1H-NMR FID积分数据数据，再运用Excel软件计算各组夹角余弦值，得到5组之间的相关系数。

2 结果与分析

2.1 脉冲序列的选择

分别选择谱仪自带的s2pul(standard twopulse sequence)和cpmgt2(Carr-Purcell Meiboom-Gill T2 pulse sequence)脉冲序列，采集1HNMR谱，考察脉冲序列对实验结果的影响，结果如图1所示。从谱图中可以看出，采用cpmgt2脉冲序列采集1H-NMR谱(B图)的实验条件，可以去除粗提取物中的大分子信号，简化谱图，因此选择cpmgt2序列作为杜仲叶1H-NMR指纹图谱的脉冲序列。

图1 提取物1H-NMRFig.1 The1H-NMR spectrum of crude extracts

2.2 杜仲叶的1H-NMR指纹图谱

本研究采用“标准样品滴定”和JRES(J-Resolved)二维核磁共振波谱实验，从黔产杜仲叶总体取物中鉴定了5个化合物(图2)，分别为绿原酸、槲皮素、紫云英苷、绿原酸甲酯、陆地锦苷及山萘酚。5个特征化合物的特征信号的化学位移及多重态分别为:绿原酸:δ7.44(d，J=16.0Hz)，7.04(s)，6.99(d，J=8.1Hz)，6.76(d，J=8.0Hz)，6.21(d，J=16.0Hz). 槲皮素:δ7.67(s)，7.54(d，J=9.1Hz)，6.88(d，J=9.4Hz)，6.41(s)，6.18(s).紫云英苷:δ8.04(d，J=7.4Hz，)，6.88(d，J=7.7Hz)，6.43(s)，6.21(s). 绿原酸甲酯 δ7.54(d，J=15.6Hz)，7.16(s)，7.05(d，J=7.2)，6.88(d，J=7.2Hz)，6.25(d，J=15.6Hz). 陆地锦苷 δ8.05(s)，7.97(s)，7.58(d，J=8.5Hz)，6.96(d，J=8.4Hz)，6.51(s)山萘酚 δ8.16(d，J=8.9Hz)，7.02(d，J=8.9Hz)，6.53(d，J=1.7Hz)，6.27(d，J=1.8Hz)。

图2 杜仲叶总体取物1H-NMR谱Fig.2 The1H-NMR spectrum of crude extracts of Eucommia ulmoides Leaves

2.3 重复性实验结果

5次重复提取的相关系数值分别为0.993，0.994，0.993，0.996，1，均在 0.99 以上，表明该方法具有较好的重现性。

3 结论

本研究采用1H-NMR分析技术，全面地体现了黔产杜仲叶的化学成分，同时使用了核磁滴定和JRES二维核磁共振波谱技术，对杜仲叶中的特征化合物进行了归属。研究结果表明，与传统的高效液相色谱方法相比，基于核磁共振的分析技术能提供更全面的信息。同时选用cpmgt2脉冲序列测试1H-NMR谱，能很好的过滤掉杜仲胶等大分子信号，简化谱图。本方法样品制备简单、分析速度快，所建立的1H-NMR指纹图谱重现性好，这为杜仲叶质量控制提供了一种新方法。

［1］辛晓明，冯 蕾，王 浩，等.杜仲的化学成分及药理活性研究进展［J］.医学综述，2007，13(19):1 057-1 059.

［2］中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志［M］.第35(2)卷.北京:科学出版社，1979:116.

［3］赵军太，张 诚.杜仲的不同部位的化学成分研究与应用［J］.实用医技杂志，2003，10(9):1 025-1 026.

［4］管淑玉，苏薇薇.杜仲化学成分与药理研究进展［J］.中药材，2003，26(2):124-129.

［5］宁康健，郑淑红，吕锦芳，等.杜仲叶水提醇沉液降压作用的实验研究［J］.中国中医药科技，2009，16(4):283-285.

［6］邱 果，包 旭，李 颖，等.杜仲叶醇提取物对小鼠免疫功能的影响［J］.中药药理与临床，2008，24(4):41-43.

［7］杨 津，董文宾，许先猛，等.杜仲叶黄酮苷抗疲劳和抗氧化活性的研究［J］.陕西大学学报，2010，28(3):60-63.

［8］董 芬，范田运，张建新，等.杜仲叶的化学成分研究［J］.天然产物研究与开发，2014，26(5):679-682.

［9］王龙星，肖红斌，梁鑫淼，等.一种评价中药色谱指纹谱相似性的新方法:向量夹角法［J］.药学学报，2002，37(9):713-717.

［10］苗爱东，孙殿甲.Excel 2002在中药指纹谱相似度计算中的应用［J］.药学进展，2003，27(1):51-54.