响应面法优化微波辅助提取翻白草中的三萜类物质

陈毅挺，李艳霞，黄 露，林如婷

（闽江学院化学与化学工程系，福建省绿色功能材料重点实验室，福建福州350108）

响应面法优化微波辅助提取翻白草中的三萜类物质

陈毅挺，李艳霞，黄 露，林如婷

（闽江学院化学与化学工程系，福建省绿色功能材料重点实验室，福建福州350108）

利用响应面法对微波辅助提取翻白草中的总三萜工艺进行研究。在单因素实验的基础上，选取提取时间、液料比和提取功率作为考察因素，以总三萜提取得率作为评价指标，利用Box-Behnken中心组合方法设计三因素三水平响应面分析法，建立数学模型，从而确定最佳提取工艺为使用无水乙醇作为提取剂，液料比控制为20 mL/g，以381 W的微波功率提取116 s，此条件下，翻白草中总三萜的提取得率达到1.305%，与理论预测值（1.252%）基本相符。此方法具有提取时间短、控制方便、节能环保等优点，有望用于翻白草中三萜类物质的提取。

翻白草，微波提取，响应面分析，总三萜

翻白草又名白头翁、天青地白等，临床上多以翻白草的水煎剂用作内服药，主治吐血、咳血、下血、妇女血崩、痢疾、疟疾、高血脂等[1]，其含有黄酮、鞣质、三萜、多酚等物质。三萜类化合物是由数个异戊二烯去掉羟基后相连构成的物质，具有镇痛、抗炎、抗菌、抗溃疡、降血糖等效应[2]。天然产物中三萜类化合物的提取方法主要有回流提取[3]、超声提取[4]、微波提取[5]、超临界流体萃取[6]、沉淀吸附[7]等。微波提取热效率高、升温速度均匀，可以大幅缩短提取时间，因此被广泛用于天然产物有效成分的提取[8]。目前，翻白草中三萜类物质的提取多集中于回流提取、超声提取等，尚未有利用微波技术对其进行提取的报道。本论文利用响应面法优化探索微波提取翻白草中三萜类化合物的最佳条件。首先通过对乙醇浓度、微波施加方式（含控制温度和控制微波功率两种形式，分别对应提取温度和微波时间、微波功率和微波时间）、料液比进行单因素实验确定响应面优化实验的考察范围，然后通过Box-Behnken模式进行组合分析，对翻白草中三萜类化合物的提取工艺进行优化。此外，还初步考察了翻白草的不同部位中三萜类化合物的大致分布，以期为翻白草的进一步开发利用提供一定的依据和参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

翻白草（全草） 亳州中药材交易市场，采自安徽凤阳周边地区；熊果酸 上海阿拉丁试剂有限公司（对照品，98.5%）；高氯酸、香草醛 分析纯，广东汕头新宇化工厂；无水乙醇、乙酸乙酯、石油醚 分析纯，上海成海化学工业有限公司；盐酸均 分析纯，天津市福晨化学试剂厂。

MCR-35型常压微波合成萃取仪 巩义市予华仪器有限责任公司；722型可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司；IKA-A11 basic型分析用研磨机 广州仪科实验室技术有限公司；RE-52C型旋转蒸发仪 巩义市予华仪器有限公司；HH-6型数显恒温水浴锅 国华电器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 翻白草的预处理 除去翻白草干草上的泥土等杂质，并用清水洗净后置于烘箱中50℃烘干，然后将翻白草用研磨机研碎，并将粉末混合均匀，以保证每次实验所用翻白草的均一性，装入塑料容器中密封待用。

1.2.2 翻白草中三萜类化合物的提取 取5 g翻白草，按一定固液比加入适量的无水乙醇，微波提取后趁热抽滤，旋干滤液，得到黄绿色浸膏。室温下以石油醚浸提至无色后用无水乙醇溶解，加适量NaOH溶液调节pH为8～9，抽滤；滤液用适量的活性炭粉末在80℃回流30 min脱色；再加入稀盐酸调节滤液pH至3～4，所得浑浊液用90 mL的乙酸乙酯萃取，取澄清液于100 mL的容量瓶，并用乙酸乙酯定容到刻度。

1.2.3 三萜类化合物的测定

1.2.3.1 熊果酸标准曲线绘制 准确称取干燥恒重的熊果酸标准样品2.5 mg，溶于无水乙醇，再定容至25 mL的容量瓶中，摇匀，得到浓度0.1 mg/mL的熊果酸标准溶液。分别吸取熊果酸标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL于7个10 mL容量瓶中，80℃水浴加热挥去溶剂，分别加入2.0 mL 5%香草醛-冰醋酸和6.0 mL的高氯酸进行显色反应，并在60℃水浴下加热20 min，冷却后用冰醋酸定容至刻度，在548 nm波长处测其吸光度，绘制熊果酸标准曲线。

1.2.3.2 样品测定 取1.2.2中获得的溶液1 mL于100 mL容量瓶，在80℃水浴下蒸干。加入2.0 mL 5%香草醛-冰醋酸和6.0 mL的高氯酸进行显色反应，并在60℃水浴下加热20 min，冷却后用冰醋酸定容至刻度，在548 nm波长处测其吸光度。由三萜类物质的标准曲线计算总三萜化合物的含量，按下式计算总三萜的提取得率。

式中：C为通过标准曲线得到的总三萜化合物的质量浓度，mg/L；V为测试液的体积，mL；n为提取液稀释的倍数；W为翻白草粉末的质量，g。

1.2.4 单因素实验 对乙醇浓度、微波施加方式（含控制温度和控制微波功率两种形式，分别对应提取温度和微波时间、微波功率和微波时间）、料液比进行单因素实验，以确定各因素影响程度和适宜范围。单因素实验只变更单因素项，其余因素不变，具体提取过程参照1.2.2，测定过程参照1.2.3。

1.2.4.1 乙醇体积分数对总三萜提取得率的影响 取5份翻白草，按20 mL/g的液料比分别加入浓度为60%、70%、80%、90%、100%的乙醇，在320 W的功率下微波提取120 s，测定不同浓度乙醇作为提取溶剂时总三萜的提取得率。

1.2.4.2 微波施加方式对总三萜提取得率的影响 实验选用的微波合成萃取仪具有两种微波施加模式，一是控制温度提取，即维持溶液温度不变，另一种是控制微波功率提取。

a.控制温度提取模式：以无水乙醇为提取溶剂，液料比为20∶1 mL/g，改变提取温度分别为50、60、70、80、90℃，均微波提取10 min，确实不同提取温度对三萜类提取得率的影响。同样使用无水乙醇为提取剂，固定液料比为20 mL/g，提取温度为80℃，分别提取3、5、10、15、20 min，研究固定温度下微波萃取时间对提取得率的影响。

b.控制微波功率提取模式：使用无水乙醇为提取剂，液料比为20∶1 mL/g，固定提取时间为120 s、改变微波功率分别为160、320、480、640、800 W，测定不同微波功率下总三萜的提取得率。固定乙醇的浓度为100%，液料比为20 mL/g，提取功率为320 W，改变提取时间分别为60、90、120、150、180 s，测定不同提取时间三萜类物质的提取得率。

1.2.4.3 液料比对总三萜提取得率的影响 以无水乙醇为提取剂，在320 W微波提取120 s，改变液料比分别为10、15、20、25、30 mL/g，以考察不同液料比对三萜类提取得率的影响。

1.2.5 响应面优化翻白草中三萜类化合物提取工艺 结合单因素实验的结果，以总三萜提取得率作为评价指标，利用Box-Behnken中心组合方法[9]，选取提取时间（A）、液料比（B）、微波功率（C）对翻白草中三萜类物质的微波提取工艺进行优化。实验因素与水平设计见表1。

表1 Box-Behnken实验设计因素和水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiment design

1.3 数据处理

采用F检验对响应面实验数据进行方差分析以评价模型的统计意义，采用Design-Expert 8.0.进行响应曲面分析。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线的绘制

以熊果酸作为三萜类物质的代表物，按照1.2.3.1中的方法进行处理后，以熊果酸浓度为横坐标，548 nm处的吸光度为纵坐标，绘制散点图（见图1）。回归方程为A=0.0756C+0.0115，相关系数r为0.9978。

图1 熊果酸标准曲线Fig.1 The standard curve of ursolic acid

2.2 单因素分析

2.2.1 乙醇体积分数对总三萜提取得率的影响 由图2可知，显示总三萜提取得率随着乙醇体积分数的增大而增大。估计是由于游离三萜类和三萜皂苷类化合物都易溶于乙醇，因此选用无水乙醇（100%）作为提取溶剂，可以使各种三萜类化合物可以最大限度地溶出，该因素不作为响应面优化的自变量。

图2 乙醇体积分数对总三萜提取得率的影响Fig.2 Effect of ethanol content on extraction yield of total triterpenoids

2.2.2 微波施加方式对总三萜提取得率的影响

2.2.2.1 控制温度提取模式 不同提取温度对三萜类提取得率的影响如图3所示。由图3可见，提取温度低于80℃时提取得率随着温度上升而增大，由于温度的升高将增加分子内能，加速溶剂分子运动，使溶剂更容易进入植物细胞，提高了得率；但是过高的温度也可能造成三萜类化合物的结构遭到破坏，所以当温度超过80℃后总三萜的提取得率反而有所降低[10]。因此选择最佳提取温度为80℃。

图3 提取温度对总三萜提取得率的影响Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction yield of total triterpenoids

考察了固定温度下微波萃取时间对提取得率的影响，结果如图4所示。从图4可以看出，随着提取时间的增加，三萜类的得率逐渐增大，当提取10 min时提取得率达到最大值。这可能是因为微波对细胞膜的破坏作用较大，从而得到较高的总三萜提取得率[11]。但长时间的微波加热会使提取物中部分三萜的结构受破坏，当提取时间超过10 min后，得率有所下降。因此温度控制模式下提取时间以10 min为宜。

图4 提取时间对总三萜提取得率的影响（80℃）Fig.4 Effect of extraction time on extraction yield of total triterpenoids with 80℃

2.2.2.2 控制微波功率模式 微波功率对提取得率的影响见图5。由图5可知，微波功率低于320 W时，三萜类的提取得率随功率增大而有所增大，但高于480 W之后三萜得率反而下降，原因可能在于微波功率过大，导致体系升温过快，使部分三萜皂苷结构被破坏。而320 W和480 W时三萜类的提取得率相近，从节约能源的角度出发，最佳微波功率选用320 W。

图5 微波功率对总三萜提取得率的影响Fig.5 Effect of microwave power on extraction yield of total triterpenoids

改变提取时间，测定恒定微波功率下提取时间对总三萜类提取得率的影响，其结果如图6所示。当提取时间低于120 s时，三萜类物质提取得率随微波处理时间的增加而提高；但是当提取时间超过120 s后，随着提取时间的延长，溶液温度不断升高，会造成部分三萜类被分解或者氧化，同时，提取时间过长也会造成其他醇溶性物质溶于提取剂中，使得三萜类化合物的得率降低。为了保证有效成分结构完好且提取得率较高，确定控制微波功率模式的最佳提取时间为120 s。

图6 提取时间对总三萜提取得率的影响（320W）Fig.6 Effect of extraction time on extraction yield of total triterpenoids with 320W

以上实验结果表明，控制温度提取模式和控制微波功率提取模式获得的总三萜提取得率相近，但是在微波功率控制下，达到类似提取得率所需要的时间大大缩短。这估计是由于为了温度保持不变，微波的施加是不连续的，物系得不到持续的微波能；而在微波功率控制下，微波的持续施加有利于总三萜的快速溶出，所以选用固定微波功率提取的方式来进行三萜提取，即将微波功率固定于320 W，提取时间确定为120 s。

2.2.3 液料比对总三萜提取得率的影响 由图7可见，提取得率先随着液料比的增大而提高，这是由于溶液容易达到饱和，总三萜难以提取完全，而液料比增大不仅有利于溶剂向细胞内渗透，还有利于三萜类物质向溶液中扩散。当液料比超过20 mL/g后，溶剂过多，原料中的杂质也会溶出，造成提取得率略微下降，而液料比过大，溶剂用量，微波加热负荷，提取时间和浓缩步骤的能耗也需要增加。因此实验选取最佳液料比为20 mL/g。

图7 液料比对总三萜提取得率的影响Fig.7 Effect of ratio of liquid to material on extraction yield of total triterpenoids

2.3 响应面优化翻白草中三萜类的微波提取工艺

以提取时间（A）、液料比（B）、微波功率（C）为自变量，总三萜提取得率（Y）为响应值，根据Box-Behnken设计进行响应面分析实验，共17组，根据Box-Behnken设计进行响应面分析实验，实验方案及实验结果见表2。

表2 响应面分析方案及实验结果Table 2 Design and results of response surface analysis

用Design-Expert 8.0软件对表2实验数据进行二次多项式逐步回归拟合，得到的三萜类物质提取得率（Y）对提取时间（A）、液料比（B）、微波功率（C）的数学模型为：

Y=1.22-0.052A－0.088B＋0.13C－0.032AB－0.15AC－0.052BC－0.46A2－0.44B2－0.20C2

表3 响应面二次回归模型的方差分析Table 3 Analysis of variance for response surface quadratic regression equation

模拟方差分析结果和各项系数显著性检验结果如表3所示。

从表3可以看出，模型的F=181.77、p＜0.0001，说明本实验采用的二次模型是极显著的，具有统计学意义。失拟项的F比模型的F值要小得多，同时p= 0.571＞0.05，没有显著意义，说明数据中没有异常点，不需要引入更高次数的项[12]。校正后的复相关系数Radj=0.9903，表明响应值（提取得率）变化的99.03%来自于所选变量，总的来说，该模型与实际实验拟合的很好，实验失拟小[13-14]。从模型系数显著性检验分析，模型的一次项A、B、C和二次项A2、B2、C2均达到极显著水平，表明实验设计的线性效应和曲面效应显著；交互项中，AC交互效应极显著。由F值的大小可以判断各因素对三萜类物质提取得率影响的强弱[15]，次序为微波功率＞液料比＞提取时间。

图8 交互项对总三萜提取得率影响的响应面图Fig.8 Response surface showing the Effect of interaction terms on total triterpenoids yield

为了直观地表现两个因素对翻白草三萜类物质提取得率的影响，可以令一个因素为固定值，分析另外两个因素提取得率的影响。图8直观地反映了各因素交互作用对响应值的影响，等高线的形状可反映出交互效应的强弱大小，椭圆形表示2个因素交互作用显著，而圆形则与之相反[16]。因此，由图可见，微波功率和提取时间的交互作用显著。同时，3个响应面均为开口向下的凸形曲面，说明三萜类物质的提取得率存在极高值。3个响应曲面的等高线中心均位于水平-1～1之间，说明提取的最优条件存在于所设计的因素水平范围之内。为确定各因素的最佳取值，用Design-Expert 8.0软件进行数值优化分析，得出回归模型存在最大值点，即最佳提取条件。其最佳的提取条件为提取时间116.46s、液料比19.41 mL/g、微波功率381.22 W。但考虑到实际操作的方便，将翻白草中三萜类的提取工艺修正为提取时间116 s、液料比20 mL/g、微波功率381 W。在此条件下，连续进行了5次微波提取，翻白草中三萜类的提取得率为1.305%，与预测值（1.252%）接近，说明该方程与实际情况拟合良好。

2.4 翻白草根茎叶中三萜类含量的比较

在实验最佳条件下对翻白草根、茎、叶的粉末分别进行提取，发现根部三萜类物质的提取得率为1.594%，茎部的提取得率为0.463%，叶部的提取得率为2.068%，即三萜类物质在翻白草中的含量从高到低为：叶＞根＞茎。该结果有助于了解三萜类物质在翻白草中各部位的分布情况，因此在提取翻白草中的三萜类物质时可注意其叶部的利用。

3 结论

利用响应面法对翻白草中的三萜类的微波提取工艺进行优化，得到的最佳工艺条件是：乙醇体积分数100%、提取时间116 s、液料比20 mL/g、微波功率381 W，实验值与响应面法预测值接近。响应面优化的微波提取法具有提取得率高、提取时间短、控制方便、节能环保等优点，有望用于翻白草中三萜类物质的提取。本研究还发现翻白草不同部位中总三萜含量具有较大的差异，这一结果为对翻白草各部位的有效应用提供了参考依据。

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Microwave assisted extraction of total triterpenes in potentilla discolor by response surface methodology

CHEN Yi-ting，LI Yan-xia，HUANG Lu，LIN Ru-ting
（Department of Chemistry and Chemical Engineering，Minjiang University，Fujian Provincial Key Laboratory of Green Functional Materials，Fuzhou 350108，China）

Response surface methodology was applied to optimize the extraction conditions of total triterpenes in potentilla discolor by microwave assisted extraction.Based on the results of the single factor experiments，the effects of three independent variables（extraction time，solid-liquid ratio and extraction power）on the triterpenes yield were investigated by a Box-Behnken experimental design of three factors and three levels.A quadratic polynomial regression equation of the forecasting model was set up.And the optimal extraction parameters to obtain the highest triterpenes yield were as follows：the ratio of liquid to solid was 20 mL/g with ethanol as solvent，microwave power was 381 W，and extraction time was 116 s.The average experimental triterpenes yield under the optimum conditions was found to be 1.305%，which agreed with the predicted value of 1.252%. This method was promising in the extraction of total triterpenes in potentilla discolor，which had advantages of less extraction time，convenient control，energy conservation and environmental protection

potentilla discolor；microwave extraction；response surface method；total triterpenoids

TS255.1

B

1002-0306（2015）22-0236-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.22.041

2015－03－19

陈毅挺（1978-），男，博士，副教授，主要从事化学传感器与现代分离分析方面的研究，E-mail：fjcyt@foxmail.com。

国家自然科学基金（21405075）；福建省工业引导性（重点）项目（2014H0040）；福建省自然科学基金（2013J01052）；闽江学院科技育苗项目（YKY13013）；闽江学院精品课程建设项目（MJW201233108）；闽江学院教学研究与改革项目（MJUB2013021）。