文蛤蛋白质组成分析及其分子量分布研究

唐小艳，郑惠娜，章超桦，郝记明，张 静

（广东海洋大学食品科技学院，广东省水产品加工与安全重点实验室，广东普通高等学校水产品深加工重点实验室，国家贝类加工技术研发分中心（湛江），广东湛江524088）

文蛤蛋白质组成分析及其分子量分布研究

唐小艳，郑惠娜，章超桦*，郝记明，张 静

（广东海洋大学食品科技学院，广东省水产品加工与安全重点实验室，广东普通高等学校水产品深加工重点实验室，国家贝类加工技术研发分中心（湛江），广东湛江524088）

为合理利用文蛤蛋白质资源，本文对其进行了蛋白质组分分离，得到了水溶性蛋白、盐溶性蛋白、不溶性蛋白及非蛋白氮4个组分，并分别对其中3个组分进行了一般成分、氨基酸组成、SDS-PAGE电泳及热稳定性分析。结果表明：新鲜文蛤含水量为84.9%、粗蛋白质含量为10.65%、灰分含量为1.20%、总糖含量为1.90%、粗脂肪含量为0.31%；4个蛋白组分占总蛋白含量分别为：盐溶性蛋白32.94%，水溶性蛋白44.69%，不溶性蛋白16.49%，非蛋白氮0.81%；文蛤蛋白氨基酸种类齐全，必需氨基酸比列均衡，必需氨基酸和呈味氨基酸含量高；SDS-PAGE电泳显示，文蛤蛋白质分子量分布广泛，但各组分之间存在一定差异性。盐溶性蛋白的分子量主要分布在200～66.4 ku和44.3～29.0 ku之间；水溶性蛋白的分子量主要集中在66.4～25 ku之间；不溶性蛋白主要集中在200～44.3 ku。DSC曲线显示：文蛤蛋白的变性温度在49.5℃，分离得到的盐溶性蛋白组分、水溶性蛋白组分及不溶性蛋白组分的热变性温度依次为：41.7、38.8和43.2℃。

文蛤，蛋白质分离，氨基酸组成，SDS-PAGE，DSC

文蛤（Meretrix lusoria）俗称花蛤、黄蛤、蛤蜊，属软体动物门、双壳纲、真瓣鰓目、帘蛤科、文蛤属。一般生活在沿海的潮间带以及浅海区的泥沙滩中。文蛤主要分布在东亚和东南亚，包括日本、韩国及我国的辽宁、山东、浙江南部、福建、广东、广西和海南沿海，是我国海水养殖的重要经济贝类之一。文蛤肉质鲜美，营养丰富，有“天下第一鲜”的美称，深受人们喜爱。目前，文蛤仍以鲜销为主，少数加工成罐头食品或干制品，产品单一、缺乏精深加工的高附加值产品，是一种尚未得到充分利用的海产贝类蛋白质资源。近年来，国内外研究者对水产蛋白的组成及食品化学特性也进行了一些研究。丁玉庭[1]采用Satio分离鲤鱼蛋白的方法对鲢鳙鳊鲫等淡水鱼肉蛋白进行了分离，得到肌原纤维蛋白、肌浆蛋白、基质蛋白、碱溶性蛋白、碱不溶性基质蛋白和醇溶性基质蛋白。郑惠娜[2]、张晶晶[3]、何小庆等[4]在Satio方法的基础上先后对马氏珠母贝、牡蛎、波纹巴非蛤等海产贝类蛋白质的组成及食品化学特性进行了研究，为合理利用海产贝类蛋白质奠定了一定基础。迄今为止，尚未见到有关文蛤蛋白质特性的研究报道。因此，充分了解文蛤蛋白质组成及其食品化学特性对合理利用这一蛋白质资源具有重要的现实意义。

本文参考Satio[5]的方法，再根据贝类肌肉蛋白组成及蛋白质溶解性的特性差异稍作修改，将文蛤蛋白质组分进行分离，得到水溶性蛋白、盐溶性蛋白、不溶性蛋白及非蛋白氮四个组分，并对各蛋白组分的含氮量、氨基酸组成、分子量分布及热稳定性进行了分析，研究结果为进一步开发利用文蛤蛋白质资源提供一定的理论基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜文蛤 购于湛江市东风市场，剥壳去内脏，用蒸馏水清洗两遍，沥干后于绞肉机中绞成肉糜，备用；SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳用蛋白标准品为TaKaRa 宝生物工程有限公司；其他试剂 均为分析纯。

PHS-25数显pH计 上海康仪仪器有限公司；BL-6205型精密电子天平 上海市岛津制作所；Avanti J-26S XP高速冷冻离心机 美国Backma公司；TJ12-A型绞肉机 广东番禹恒联食品机械厂；T25型高剪切乳化分散机 德国IKA；KDN-12C型数显消化炉 上海新嘉仪器有限公司；VULCAN 3-550型马弗炉 美国Neytech公司；UV-2102PC型紫外分光光度计 尤尼柯（上海）仪器有限公司；ECP3000型电泳仪、DYCZ-24DN型双垂直电泳槽 北京六一仪器厂；Alphal-4型真空冷冻干燥机 德国Christ公司；Gel Doc XR凝胶成像仪 美国BIO-RAO公司；DSC204F1型差示扫描量热仪 德国NETZSCH公司。

1.2 实验方法

1.2.1 一般组分测定 水分测定：105℃干燥法GB/T 50093-2010[6]；灰分测定：马弗炉550℃干法GB/T 5009.4-2010[7]；粗蛋白含量测定：微量凯氏定氮法GB/T 5009.5-2010[8]；总糖测定：苯酚硫酸法GB/T 9695.31-2008[9]；粗脂肪测定：索氏抽提GB/T 9695.7-2008[10]。

1.2.2 蛋白质分离方法 分别称取经过纯水清洗沥干的蛤肉100 g于1000 mL烧杯中，按1∶4比例加入冰纯水（4℃预冷），10000 r/min均质化90 s，4℃下提取90 min后4℃、10000 r/min下离心20 min，得到上清液和沉淀，将沉淀重新按1∶4比例加入冰纯水（4℃预冷）10000 r/min均质化90 s，4℃下提取90 min，4℃、10000 r/min下离心20 min，得到上清液和沉淀，收集再次离心的上清液合并，然后在收集的上清液中加入等量的5%的三氯乙酸溶液，静置90 min，10000 r/min下离心20 min，得到的沉淀即为水溶性蛋白，上清液为非蛋白氮。收集上述重复操作2次得到的沉淀按1∶4比例加入0.6 mol/L NaCl，0.1 mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液4℃预冷，混匀后用高速匀浆机于10000 r/min下间歇性匀浆90 s，匀浆液于4℃下抽提18 h后离心（10000 r/min，20 min，4℃），收集上清液即得盐溶性蛋白溶液，沉淀即为不溶性蛋白。

1.2.3 蛋白含量测定 根据以上方法对文蛤进行蛋白质分离，用微量凯氏定氮法（GB/T 5009.3-2003）分别测定总蛋白含量、各组分蛋白含量及非蛋白氮含量。

1.2.4 蛋白质脱盐 选用规格为3500 Mw的透析袋进行脱盐，放入透析槽中透析，透析液采用纯水。用1%AgNO3（1～2滴）检验氯离子的存在，并勤换水至透析液中无白色沉淀生成为止。脱盐的上述蛋白质冷冻干燥备用。

1.2.5 蛋白质组分的氨基酸组成分析 氨基酸的测定按照GB/T 5009.124-2003方法：取适量文蛤分离得到的三种蛋白干粉，加入6 mol/L的盐酸，110℃条件下水解22 h后，采用氨基酸自动分析仪以外标法测定试样中的氨基酸含量。色氨酸的测定按照GB/T 18246-2000碱水解方法：取适量蛋白在110℃、碱的作用下水解，再通过离子交换色谱分离测定。

1.2.6 蛋白质组分的SDS-PAGE分析 取上述各组分蛋白，稀释至蛋白浓度约为2 mg/mL（不溶性蛋白用5%的SDS进行溶解），然后加入2X的上样缓冲液处理。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳条件如下：分离胶12%，浓缩胶5%，设定电泳仪电压为120 V，电流为50 mA，时间为3 h。考马斯亮蓝R-250染色2 h，脱色液（冰醋酸∶乙醇∶蒸馏水=1∶1∶8）脱色直至凝胶板蛋白质染色条带清晰为止，用凝胶成像仪拍照。

1.2.7 蛋白质组分DSC热稳定性分析 分别取2～5 mg左右的文蛤肉及各分离组分蛋白粉置于铝盒中，用样品封压机密封，使试样与铝盒紧密接触，以空铝盒作为空白对照。检测条件为：N2流速20 mL/min，升温速率10℃/min，温度扫描范围（-20～100）℃。

1.3 数据处理分析

使用Origin 8.0、JMP 7.0和Excel 2003软件进行数据处理和绘图。

2 结果与讨论

2.1 文蛤基本营养组成

文蛤的基本营养组成如表1所示。除水分外，新鲜文蛤肉粗蛋白含量最高，占原料10.65%，脂肪含量最低，占原料0.31%，总糖含量占原料1.90%，灰分占原料1.20%。在以干基计的情况下与杨晋等[14]测得的文蛤粗蛋白含量（53.03%，以干基计）及李晓英等[15]测得的文蛤粗蛋白含量（65.82%，以干基计）结果相差较大，这可能是采样的季节、区域以及个体大小不同而导致文蛤本身营养组成存在差异所引起的误差。从表1可以看出，相比较于其他贝类的基本营养组成而言，文蛤的蛋白质含量（70.53%）高于波纹巴非蛤（68.77%）[4]和近江牡蛎（50.63%）[13]，略低于缢蛏（70.83%）[11]和马氏珠母贝（74.13%）[12]。从表1还可以看出，文蛤的粗脂肪含量除略高于马氏珠母贝外，均低于表1中其他三种常见的双壳贝类。总糖含量除低于近江牡蛎外，均高于其他三种常见的双壳贝类。而据研究表明，贝类总糖与呈味有关[14]。文蛤被称为“天下第一鲜”可能与此有一定关系。由此可知，文蛤是一种高蛋白、低脂肪并具有美好风味的重要资源，值得重视和利用。

表1 文蛤与部分贝类的基本营养组成比较（%）Table 1 Nutrition composition of Meretrix lusoria compared with other shellfishes（%）

2.2 文蛤蛋白质组成

文蛤蛋白质组成分析结果见图1。

图1 文蛤肉蛋白质组成Fig.1 Protein compositions of Meretrix lusoria

由图1可知，在文蛤粗蛋白含量为10.65%±0.03%的条件下，水溶性蛋白在各分离组分中含量是最高的，占总蛋白含量的44.69%，其次是盐溶性蛋白，占总蛋白含量的32.94%，不溶性蛋白和非蛋白氮分别占16.49%和0.81%。就贝类而言，水溶性蛋白即肌浆蛋白成分较复杂，含有很多与代谢相关的酶蛋白，如乳酸脱氢酶、醛缩酶、TG酶等[16]。文蛤死后易腐败变质，在提取水溶性蛋白时易发生褐变等现象，可能与水溶性蛋白含量高（44.69%）有一定的关系。与何小庆[4]研究波纹巴非蛤蛋白质组分含量相比，波纹巴非蛤的水溶性蛋白为31.2%低于文蛤的水溶性蛋白，而盐溶性蛋白含量（45.42%）显著高于文蛤。盐溶性蛋白即肌原纤维蛋白主要由肌动蛋白和肌球蛋白及部分副肌球蛋白构成，在肉的加工和贮藏过程中起着重要的作用，也是衡量鱼糜制品品质好坏的主要因素。但是相对于其他水产品而言，如鱼类的全蛋白中肌原纤维蛋白的含量在50%～70%之间[17]，文蛤的肌原纤维蛋白含量较低，可能与文蛤内源性蛋白酶含量较高，在提取过程中将部分盐溶性蛋白质水解有关，这与张晶晶[3]研究牡蛎蛋白质组成推测结果相一致，也有可能文蛤本身的蛋白质组成就是如此。不溶性蛋白即肌基质蛋白包括胶原和弹性蛋白是构成结缔组织的主要成分。在分离各蛋白组分时，最后得到的不溶性蛋白如果冻一般，表面光滑、整体流动性好，这可能是其不溶性蛋白含量较高所致。

2.3 文蛤肌肉及各蛋白质组分的氨基酸组成分析

食品中的蛋白质是构成人体生命活动的物质基础，是人体的必需营养素。而氨基酸是组成蛋白质的基本单元，充分了解食品的氨基酸组成对合理膳食具有重要的意义。文蛤肉及各蛋白质组分氨基酸组成如表2所示。从文蛤肉中分离得到的3个蛋白组分均含有常见的17种氨基酸，其中包括8种人体必需氨基酸、6种呈味氨基酸和3种支链氨基酸，与文蛤肉的氨基酸组成基本一致。根据FAO/WHO的理想模式，质量较好的蛋白质必需氨基酸的含量在40%左右[18]。必需氨基酸的含量是指苏氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸和色氨酸8种必需氨基酸占氨基酸总和的值。文蛤肉的必需氨基酸含量为37.30%，并且含量均衡，接近理想模式，属于较为优质的蛋白质。各蛋白组分必需氨基酸含量盐溶性蛋白最高，达到37.91%，其次是水溶性蛋白为36.57%，不溶性蛋白必需氨基酸含量最低为32.92%。

从氨基酸组成分析，3种蛋白组分中谷氨酸（Glu）的含量是17种氨基酸中最高的，水溶性蛋白、盐溶性蛋白、不溶性蛋白中含量分别达14.60%、19.59%、15.05%。盐溶性蛋白中除Glu外，Asp、Ile、Leu、Lys和Arg的含量也均高于其他两种蛋白。张向阳等[19]研究发现谷氨酸对提高记忆力、延缓衰老有一定的作用。有研究发现：亮氨酸具有促进氮储留、增加亮氨酸-tRNA的水平、促进蛋白质合成的作用[20]。Noguchi S等[21]研究发现，赖氨酸具有增强食欲、促进钙吸收、加速骨骼生长，促进幼儿生长发育的作用。赖氨酸是人乳和谷物蛋白中第一限制氨基酸，但在我国大部分人是以谷物为主食的，因此摄入富含赖氨酸的食物对改善国民营养不均衡状况具有重要意义。从表2还可以发现，文蛤肉的呈味氨基酸含量很高，达到49.31%，这与贝肉风味独特、肉质鲜美息息相关。呈味氨基酸的含量是指谷氨酸、天门冬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸6种呈味氨基酸占氨基酸总和的值。分离得到的3种蛋白组分的呈味氨基酸含量最高的是不溶性蛋白为52.94%，其次是水溶性蛋白为51.55%，盐溶性蛋白为48.29%。此外，文蛤肉的支链氨基酸含量也较高，其中盐溶性蛋白组分的支链氨基酸含量高于其他两种蛋白，达18.55%。支链氨基酸的含量是指亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸3种支链氨基酸占氨基酸总和的值。有研究发现：支链氨基酸具有独特的生理功能，不仅能消除或减轻肝性脑病症状，改善肝功能和病人蛋白质营养失调状态，还具有抗疲劳功效[12]。

表2 文蛤肉及各蛋白质组分氨基酸组成分析（%）Table 2 Hydrolytic amino acid composition of protein component in Meretrix lusoria（%）

2.4 文蛤各蛋白组分分子量分布研究

文蛤各蛋白组分分子量分布如图2所示。3种蛋白的分子量主要分布在200～29.0 ku之间，但各蛋白组分也具有一定的差异性。从电泳图谱上可以得到，盐溶性蛋白的分子量主要分布在200～66.4 ku和44.3～29.0 ku之间，并且在200、97.2、44.3、35 ku附近有明显蛋白条带。盐溶性蛋白主要由肌球蛋白重链（MHC）、轻链（MLC）及肌动蛋白等构成，200 ku处为肌球蛋白重链，44.3 ku处为肌动蛋白，35 ku附近处的蛋白条带为原肌球蛋白。对于贝类而言，盐溶性蛋白中还存在一种副肌球蛋白，相对分子量在100 ku左右，即泳道2中最明显、颜色最深、分布在97.2 ku附件的条带，并且从图谱上可知其在盐溶性蛋白中所占比例较大。水溶性蛋白的分子量在200～14.3 ku都有分布，但主要集中在66.4～25 ku之间，电泳条带成连续状，并且有两条明显的条带，分布在44.3、35 ku附近，由此可以说明水溶性蛋白是由很多分子量相近的蛋白组成，这与牡蛎[6]、波纹巴非蛤[7]的水溶性蛋白电泳分布情况相一致。不溶性蛋白主要集中在200～44.3 ku，在45.2 ku处有一条较明显蛋白条带，在162.2、143、103.7、51.1 ku处条带较浅，在小于20.1 ku的低分子量区也有一些很浅的条带，这与牡蛎、波纹巴非蛤的不溶性蛋白电泳分布情况存在差异，可能是由于不溶性蛋白的溶解性不好导致上样浓度偏低引起的。

图2 文蛤蛋白质组分SDS-PAGE电泳图谱Fig.2 SDS-PAGE of the protein fractions in Meretrix lusoria

2.5 文蛤肉及各蛋白组分热稳定性分析

图3 文蛤蛋白DSC图Fig.3 DSC thermo gram for Meretrix lusoria

物质在一较宽的温度范围内变化时，会发生某种物理或化学变化，这些变化会引起系统温度和热焓不同程度的改变，并伴随着热量形式的吸收或释放，热分析就是研究与温度有关的物性的变化。热处理是食品加工的常用方法，加热可引起蛋白质的高级结构发生改变或使蛋白质发生降解。因此了解食品蛋白质的热稳定性对合理利用蛋白质具有重要作用。对于DSC而言，在热分析图谱上出现吸热峰通常表示该点已处在蛋白质热变性温度区，并且这个峰值（Peak）对应的温度即为该样品的热变性温度（Td）[22]。文蛤肉及各蛋白组分差示扫描量热（DSC）结果如图3所示。从图谱上可以发现，除了曲线2有两个小峰外，曲线1、3、4的吸热峰不太明显，曲线比较平滑，并且出现吸热峰对应的温度较低，说明文蛤蛋白质变性温度相对于鱼及牡蛎[3]等水产品而言是较低的。曲线1是文蛤肉的DSC图谱，从图谱上可以知道在49.5℃处有一个向上的峰，即在该处为文蛤蛋白质变性的温度。曲线2、3、4分别是盐溶性蛋白、水溶性蛋白和不溶性蛋白的升温DSC曲线，其蛋白质变性的温度分别是：41.7、38.8和43.2℃。其中水溶性蛋白的热变性温度最低。说明文蛤水溶性蛋白的稳定性较盐溶性蛋白的差，盐溶性蛋白主要由肌球蛋白和肌动蛋白组成。有研究表明肌动蛋白是热稳定性最强的蛋白质，其开始变性的温度为71℃[23]；肌球蛋白的变性温度在40～60℃之间，是较易发生变性的蛋白质[24]。从图谱2上可知，肌球蛋白的变性温度为41.7℃，肌动蛋白的变性温度为60.9℃，肌球蛋白的稳定性比肌动蛋白的稳定性差。这与张晶晶[6]研究牡蛎蛋白质热稳定性结果相一致。

3 结论

文蛤是一种高蛋白低脂肪的海产食品，贝肉蛋白质中水溶性蛋白含量＞盐溶性蛋白含量＞不溶性蛋白含量＞非蛋白氮含量。文蛤蛋白质中氨基酸种类齐全、组成合理，必需氨基酸含量均衡；呈味氨基酸含量最高，约占氨基酸总量的一半；支链氨基酸含量也较高。这为合理利用该蛋白资源提供了一定依据。对文蛤肉分离得到的三个蛋白组分进行了SDS-PAGE电泳分析，结果发现文蛤蛋白质分子量分布广泛，但各组分之间存在一定差异性。盐溶性蛋白的分子量主要分布在200～66.4 ku和44.3～29.0 ku之间，并且盐溶性蛋白中副肌球蛋白含量较多；水溶性蛋白的分子量广泛分布在200～14.3 ku之间，并且电泳条带成连续状，说明文蛤水溶性蛋白成分较为复杂；不溶性蛋白主要在45.2 ku处有一条较明显的蛋白条带，在162.2、143、103.7、51.1 ku处条带较浅，在小于20.1 ku的低分子量区也有一些很浅的条带，这可能与其溶解性较差有一定关系。对文蛤肉及分离得到的三种蛋白进行了DSC测定，发现文蛤蛋白是一种易发生热变性的蛋白质，各蛋白组分的热变性温度均较低。分离得到的盐溶性蛋白组分、水溶性蛋白组分及不溶性蛋白组分的热变性温度依次为：41.7、38.8和43.2℃。

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Protein composition analysis and molecular weight distribution of Meretrix lusoria

TANG Xiao-yan，ZHENG Hui-na，ZHANG Chao-hua*，HAO Ji-ming，ZHANG Jing
（College of Food Science and Technology，Guangdong Ocean University，Guangdong Province Key Laboratory of Aquatic Products Processing and Safety，Key Laboratory of Advanced Processing of Aquatic Products of Guangdong Higher Education Institution，National Research and Development Branch Center for Shellfish Processing（Zhanjiang），Zhanjiang 524088，China）

In order to make full use of protein，the Meretrix lusoria protein was separated in this paper，and four components of protein：the water-soluble protein，the salt-soluble protein，insoluble protein and non-protein nitrogen were obtained，and the general composition，the consist of amino acid，the SDS-PAGE electrophoresis and the thermal stability of the three protein were analyzed respectively.The results showed that the moisture，crude protein，ash content，total sugar and crude fat of fresh Meretrix lusoria were 84.9%，10.65%，1.20%，1.90%，0.31%，respectively，among the raw protein，the salt-soluble protein，water-soluble protein，insoluble protein and non-protein nitrogen were accounted for 32.94%，44.69%，16.49%，0.81%，respectively.There were various of amino acids in Meretrix lusoria，and the ratio of essential amino acids were appropriate，the contents of essential amino acid and flavor amino acid were high.The results of SDS-PAGE showed that the protein molecular weight of Meretrix lusoria was widespread，but there were some differences among the components：the weight of salt-soluble protein molecular was mainly distributed in 200～66.4 ku and 44.3～29.0 ku，the weight of water-soluble protein molecular was mainly concentrated in 66.4～25 ku，the weight of insoluble protein was mainly concentrated in the 200～44.3 ku.The DSC curves showed that the denaturation temperature of Meretrix lusoria protein was 49.5℃，the denaturation temperature of salt-soluble protein，water-soluble and insoluble protein were 41.7，38.8 and 43.2℃，respectively.

Meretrix lusoria；protein separation；amino acid composition；SDS-PAGE；DSC

TS254.1

A

1002-0306（2015）22-0362-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.22.066

2015－04－02

唐小艳（1989-），女，硕士研究生，研究方向：水产品深加工，E-mail hhxxtxy@126.com。

*通讯作者：章超桦（1956-），男，教授，研究方向：水产品加工及高值化利用，E-mail zhangch2@139.com。

国家现代农业产业技术体系（CARS-48-07B）；广东省高校重大科研项目培育计划（GDOU2013050245）；广东省高等学校优秀青年教师培养计划（Yq2014005）；水产蛋白改性技术研究（2011A020102005）。