自然发酵腐乳中芽孢杆菌的分离与鉴定

刘 阳，邹 伟，左上春，李玉斌，赵兴秀

（四川理工学院，生物工程学院，四川自贡643000）

自然发酵腐乳中芽孢杆菌的分离与鉴定

刘 阳，邹 伟*，左上春，李玉斌，赵兴秀

（四川理工学院，生物工程学院，四川自贡643000）

从自然发酵腐乳中筛选芽孢杆菌并研究其作用。根据菌株产蛋白酶能力大小，对自然发酵腐乳中细菌进行分离纯化获得四株芽孢杆菌，经纯化培养后观察其个体形态和菌落形态，利用Biolog微生物自动鉴定系统和16S rDNA序列分析对其精确鉴定。结果显示四株菌株分别为：一株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis B），两株蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus B），一株解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens B）。

腐乳，芽孢杆菌，Biolog微生物鉴定，16S rDNA序列分析

腐乳是我国传统的大豆发酵食品，是由微生物固态发酵豆腐，经盐水和酒后熟而制得，其风味独特、营养丰富、价格低廉，已受到国内外食品和营养学者的广泛关注。根据加工方法的不同可以将腐乳分为：自然发酵腐乳、霉菌发酵腐乳、细菌发酵腐乳和酶法腐乳。腐乳制作工艺大致相同，只是自然发酵腐乳是在空气中自然接种，而其他腐乳是通过人工接种经纯培养的霉菌、细菌等发酵而成[1-2]。目前家庭自制腐乳一般是在适宜的温度下，自然接种空气中霉菌产生的孢子发酵。在发酵过程中，除优势菌群——霉菌发挥主要作用以外，芽孢杆菌的重要性也不能忽视，因此，对腐乳中的芽孢杆菌进行分离鉴定，进一步可深入探讨其在腐乳发酵中发挥的作用。

芽孢杆菌是一类好氧微生物，具有抗逆性强、营养需求低、复活率高、生长速度快等特点，并可产多种酶类、能有效抑制病原菌生长，被视为最理想的益生菌类之一，常作为动物微生态制剂生产菌种[3-6]。目前，芽孢杆菌应用非常广泛。丁祥力等的研究表明，在水产养殖过程中，枯草芽孢杆菌能够显著去除亚硝酸盐、硫化物等，有效改善淡水养殖水体的水质[7]；李小刚等在研究巨大芽孢杆菌对蛋鸡生产性能、养分消化率及血清指标的影响时发现，巨大芽孢杆菌1259能够显著提高其谷丙转氨酶的活性和钙、磷含量[8]；钱英等对解淀粉芽孢杆菌的抑真菌作用进行了研究，结果表明，解淀粉芽孢杆菌BW-13发酵滤液对植物病原菌灰霉具有显著的拮抗作用[9]。在腐乳的研究中，关于芽孢杆菌的报道很少，杨佐毅等[10]曾从白腐乳中分离出一株蜡状芽孢杆菌，并阐述了该菌在腐乳中的生产与保藏中的食用安全性，而其他关于芽孢杆菌的研究报道则更少。

本实验根据不同菌株产蛋白酶的能力强弱，从家庭自制的自然发酵腐乳中筛选出四株芽孢杆菌，并分析这四株菌在自然发酵腐乳过程中可能发挥的作用，为其在自然发酵腐乳的大规模生产应用中奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

腐乳 市售，四川自贡川南地区家庭自制发酵的红腐乳和白腐乳；牛肉膏蛋白胨培养基 牛肉膏3 g/L，蛋白胨10.0 g/L，NaCl 5 g/L，琼脂20.0 g/L，pH7.2～7.4，加热融化后121℃灭菌20 min；平板分离培养基蛋白胨2.5 g/L，葡萄糖1 g/L，酵母膏1 g/L，干酪素10 g/L，琼脂20.0 g/L，pH7.2～7.4，加热融化后121℃灭菌20 min；斜面培养基 蛋白胨5 g/L，牛肉膏3 g/L，NaCl 5 g/L，琼脂20.0 g/L，pH7.2～7.4，加热融化后121℃灭菌20 min。

T6新世纪紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；LG10-2.4A高速离心机 北京医用离心机厂；TDL-5C型低速台式离心机 上海安亭科学仪器厂；868型pH计 上海热电仪器有限公司；CX31-72C02型显微镜 日本NIKON公司；Gen III Microstation型Biolog菌种鉴定仪 美国biolog公司等；DY-6C型电泳仪 北京市六一仪器厂；GelDoc 2000型凝胶成像系统、S1000型PCR扩增仪 美国BIO-RAD公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌体富集培养 称取腐乳样品1 g，加入99 mL带玻璃珠的无菌水中，振荡，制成10-2的菌悬液。吸取1mL 10-2的菌悬液于9 mL的无菌水中，制得10-3的菌悬液，依次制得10-4、10-5、10-6、10-7的菌悬液，分别取各个梯度的菌悬液0.2 mL涂布于牛肉膏蛋白胨培养基上，置于35℃培养箱中恒温培养1～2 d。观察菌落的生长变化。每个稀释度做3个平行。

1.2.2 菌体分离、纯化 将上述富集培养后的菌落划线转接于酪蛋白平板分离培养基上，置于30℃的恒温培养箱中培养1～2 d，观察产生透明圈的情况。挑取产透明圈较大的菌落以分区划线的方式接入酪蛋白培养基中。置于30℃的恒温培养箱中培养1～2 d，观察产生透明圈的情况。再次挑取单个透明圈与菌落直径比值大的菌落以平板分区划线的方式接种于酪蛋白培养基上，进行菌种的纯化。如此反复纯化5次后，镜检观察是否得到了纯菌落。

1.2.3 菌种鉴定 通过革兰氏染色确定所分离到的菌株是G-或G＋，在显微镜下观察其菌体形状及是否产芽孢，并通过Biolog菌种鉴定和16S rDNA序列分析进一步分析鉴定各菌株。

1.2.3.1 Biolog菌种鉴定 Biolog鉴定原理[11]：利用微生物对不同碳源代谢率的差异，针对微生物在利用碳源过程中产生的自由电子与四唑盐染料发生还原显色反应（颜色的深浅程度可以反映微生物对不同碳源的利用程度），以及由于微生物生长造成的浊度差异，与标准菌株数据库进行对比，即可得出最终鉴定结果。每种结果显示3个参数，即可能性（PROB），相似性（SIM）和位距（DIS）。SIM表示测定结果与数据库中相应数据条的相似程度，DIS表示测定结果与数据库相应数据条的位距。如果鉴定结果与数据库匹配良好，状态栏为绿色，若鉴定结果不可靠，状态栏为黄色，并显示“NO ID”字样，但仍会列出最可能的10种结果。

Biolog系统规定：细菌培养4～6 h，其SIM值≥0.75，培养16～24 h时，SIM值≥0.50，系统自动给出的鉴定结果为种名，SIM值越接近1.00，鉴定结果的可靠性越高；当SIM值小于0.5，但鉴定结果中属名相同的结果的SIM值之和大于0.5时，自动给出的鉴定结果为属名。

1.2.3.2 16S rDNA序列分析 采用细菌通用扩增引物，即27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3’和1492R：5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’，以菌种基因组为模板进行PCR扩增。反应程序：94℃预变性5 min，94℃变性60 s，50℃退火60 s，72℃延伸90 s，30个循环，72℃延伸10 min。利用胶回收PCR扩增产物，送华大基因科技股份有限公司测序。在NCBI网站中使用Blastn功能将测序得到的16S rDNA序列与GenBank数据库中已知标准菌16S rDNA序列进行同源性比对分析，进一步准确鉴定菌株。

2 结果与分析

2.1 菌种的分离筛选

菌样在牛肉膏蛋白胨平板上富集培养的结果如图1。转接到酪蛋白分离平板上后，其产生酪蛋白水解圈如图2。根据不同时间内对酪蛋白水解圈的直径（D）与菌落直径（d）的比值的大小的测定，选出4株比值较大的菌株，分别编号为：A1、A2、A3、B2，其透明圈直径与菌落直径的比值分别为4∶1、5∶1、3∶1、4∶1。将4株菌进行进一步纯化，得到纯种菌株，进而后续实验。

图1 菌种在牛肉膏蛋白胨培养基上的生长Fig.1 Growth of strains in beef extract peptone medium

图2 分离菌在酪蛋白平板上产生的水解圈Fig.2 Hydrolysis circle of isolated bacteria in casein medium

2.2 菌种的鉴定

2.2.1 菌落形态、个体形态的观察 培养24 h后观察菌落形态，A1菌落大而扁平，呈乳白色，中间厚边缘薄，不透明，干枯；A2菌落大而扁平，乳白色，不透明，边缘不是很整齐，干枯；A3菌落扁平，中间厚边缘薄，且中间呈乳白色，边缘较透明。B2菌落与A1相似，较A1小。通过显微镜观察得出，A1、A2、A3、B2均有芽孢，且都是短杆菌，经革兰氏染色后得到四株菌均为G＋菌。

2.2.2 Biolog微生物自动分析系统鉴定结果 利用Biolog菌种鉴定仪对分离到的4株菌进行鉴定，分别在4～6 h及16～24 h内各进行了数据的读取，结果见表1。一般16～24 h的结果较为稳定，从表2中可以看出，A1菌SIM值=0.62＞0.5，DIS=3.45＜5.0，PROB=96%，所以可以确定A1为Bacillus cereus B；A2菌SIM值= 0.46＜0.5，DIS=8.32＞5.0，没有PROB值，但结果给出了可能相似的10株数据库内的菌种，其中1号菌为Bacillus subtilis B，出现这种结果的可能原因有很多，其一可能是操作失误，其二可能是该菌种不在数据库中；A3菌SIM值=0.53＞0.5，DIS=4.96＜5.0，PROB= 90%，所以可以确定A3为Bacillus cereus B；B2菌SIM值=0.58＞0.5，DIS=4.32＜5.0，PROB=98%，所以可以确定B2为Bacillus amyloliquefaciens B。

2.2.3 16S rDNA序列分析结果 为了进一步的确定A2菌是否为枯草芽孢杆菌，又利用16S rDNA序列分析对其进行鉴定。将A2菌16S rDNA序列（如表2）与GenBank数据库中的序列做相似性分析，结果表明，A2菌与标准菌株FJ435215.1的同源相似性达到99%。挑选Blast比对后的部分序列构建系统发育树，见图3。结果显示A2菌与标准菌株FJ435215.1聚在同一枝上，说明他们的亲缘关系最近，可确定A2为 Bacillus subtilis。

图3 A2菌的系统发育进化树Fig.3 Phylogenetic tree of strain A2

表1 Biolog菌种鉴定结果Table 1 Result of identification of microorganisms by Biolog

表2 A2菌株16S rDNA测序结果Table 2 The sequencing result of 16S rDNA of the strain A2

3 结论与讨论

本实验从自然发酵的腐乳中筛选出四株芽孢杆菌，利用Biolog微生物自动鉴定系统、16S rDNA序列分析，最终得到一株枯草芽孢杆菌、两株蜡样芽孢杆菌、一株解淀粉芽孢杆菌。这三种菌在腐乳自然发酵过程中可能起着重要作用：枯草芽孢杆菌自身能够合成淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶和多种维生素B族，因此在协助霉菌分解蛋白质同时，还能够增加腐乳营养价值[12]；蜡样芽孢杆菌是抗生素抗菌活性的测定菌，能够产生抑菌物质，抑制有害微生物繁殖，还可以产生蛋白酶，但是又会引起食物中毒，因此控制腐乳中蜡样芽孢杆菌的数量是食品安全的重要保证[13]；解淀粉芽孢杆菌能够广泛地抑制真菌和细菌活性，具有很强的次级代谢产物生产能力，因此可能对腐乳中杂菌的抑制和多种有机活性成分的产生起到一定的作用[14]。

综上，在自然发酵腐乳中得到的四株芽孢杆菌具有安全可靠的食源性，下一步实验应进一步研究其在自然发酵腐乳过程中的作用，以便为其在自然发酵腐乳的大规模生产中应用奠定基础。

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Isolation and identification of Bacillus in the natural fermentation of sufu

LIU Yang，ZOU Wei*，ZUO Shang-chun，LI Yu-bin，ZHAO Xing-xiu
（College of Bioengineering，Sichuan University of Science&Engineering，Zigong 643000，China）

To screen the bacillus in the natural fermented sufu and study its function，according to the ability of protease production，bacteria in the naturally fermented bean curd were isolated and purified.Totally，four Bacillus were obtained.Then，those four stains were identified via a combination of individual shape and colony morphology observation，Biolog Microbial Identification System，and 16S rDNA sequence analysis.The four strains were identified as：one Bacillus subtilis B，two Bacillus cereus B，and one Bacillus amyloliquefaciens B，respectively.

sufu；Bacillus；Biolog microorganisms identification system；16S rDNA sequence analysis

TS201.1

A

1002-0306（2015）22-0213-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.22.036

2015－03－31

刘阳（1990-），男，硕士研究生，研究方向：食品生物技术，E-mail：yangliuy521l@163.com。

*通讯作者：邹伟（1985-），男，博士，讲师，研究方向：食品发酵技术，E-mail：gubai1985@gmail.com。

四川理工学院校级项目（2013RC12）；四川理工学院学科特色培养项目（2013TS15）。