甲状腺乳头状癌中HER-2、CyclinD1 的表达与颈部淋巴结转移的相关性

罗思佳，李汉军，叶家欣，高友兵

（湖北武汉市广州军区武汉总医院，武汉 430070）

甲状腺乳头状癌（Papillary Thyroid Cancer，PTC）是一种内分泌系统最觉见的恶性肿瘤，约占甲状腺癌的80%，近年来，其发病率呈现急剧增长的态势［1-3］。多数PTC 可通过手术的方法进行治疗，且预后良好，死亡率低。早期诊断是PTC 的治疗关键，近年来随着分子生物学技术水平的迅速发展，采用基因技术对PTC 进行早期诊断成为研究热点。一些研究证实，HER-2/neu癌基因在乳腺癌和胃癌临床诊断治疗中有重要意义［4］，但HER-2 在PTC 上的表达状况却少有研究［5］；目前虽然已有用CyclinD1 表达状况作为PTC 中的病理诊断指标，但研究结果尚不一致［6，7］，仍需进一步验证。

1 资料与方法

1.1 材料来源收集广州军区武汉总医院病理科自2011 年1 月1 日至2013 年12 月31 日存档的PTC 手术病例组织蜡块标本85 例为实验组，甲状旁腺肿及瘤旁正常组织标本85 例为对照组。实验组患者年龄26～75岁，平均56 岁，其中男性28 人，女性57 人；其中微小癌17 例，弥温硬化型18 例，高细胞型19 例，嗜酸细胞型4 例，弥漫硬化型15 例，包裹型17 例；发生颈部淋巴结转移31 例；按照AJCC 制定的2002 年版甲状腺癌的TNM 分期标准，I 期36 例，II 期33 例，III 期16 例。对照组患者年龄30～79 岁，平均51 岁，其中甲状腺滤泡性腺瘤31 例，慢性淋巴细胞性甲状腺炎9 例，结节性甲状腺肿40 例，甲状腺嗜酸细胞瘤5 例。

1.2 病例纳入排除标准纳入标准：所有患者手术前均未行内、外放射治疗；标本均经常规病理诊断确诊；PTC 初次切除术后原发灶无癌残留。排除标准：术后复发病例标本；有远处脏器转移病例标本；初次手术后原发灶有癌残留者。

1.3 试剂与方法即用型HER-2 鼠抗人单克隆抗体（克隆号CB11），购自福州迈新生物技术开发有限公司；CyclinD1 单抗（克隆号SP4），购自武汉博士德生物工程有限公司。采用免疫组化方法为石蜡包埋切片为5 μm连续切片，裱于经多聚赖氨酸处理的载玻片上，56℃烤片3 小时后，37℃恒温箱中过夜，置于-20℃冰箱中待用。免疫组化染色采用Envision 两步法检测HER-2 和CyclinD1 蛋白表达，按试剂盒说明书操作，使用已知阳性切片（HER-2）和血管内皮细胞（CyclinD1）作为阳性对照，PBS 代替一抗为阴性对照。

1.4 判读标准

1.4.1 HER-2 在PTC 中的判读标准由于尚未有公认的甲状腺癌中HER-2 的判读标准，参考胃癌和乳腺癌的HER-2 判读标准进行，将PTC 中免疫组化检测出的HER-2（++，+++）定为阳性。⑴阴性: 无着色；⑵HER-2(+)；任何比例的PTC 癌细胞呈现微弱细胞膜着色；⑶ HER-2(++）：>10%的PTC 癌细胞呈现弱至中等强度的基底侧膜、侧膜或完全性的细胞膜棕黄着色或<30%的PTC 癌细胞呈现强的基底侧膜，侧膜或完全性的细胞膜棕黄着色；⑷HER-2(+++)：>30%的PTC 癌细胞基底侧膜、侧膜或完全性膜强棕黄着色。

1.4.2 CyclinD1 在PTC 中的判读标准CyclinD1 蛋白阳性表达定位于细胞核或胞浆阳性信号为呈棕色或棕褐色细颗粒状。在同一光强亮度下，阳性判断标准参照 Takahashi 等的方法，同一高倍镜下（×400 倍）每张切片随机选取 10 个视野进行拍照计数，根据染色程度和着色细胞百分率进行半定量结果判断：胞核或者胞浆基本不着色记 0 分，阳性细胞按染色淡黄色、棕黄色、棕褐色依次记为 1~3 分；着色细胞占计数细胞百分率≤5%记 0 分，6%~25%记 1 分，26%~50%记 2 分，>50%记 3 分，两项得分乘积作为最后判断结果：评分，分值<2 者为染色阴性，分值≥2 者为染色阳性。

1.5 统计方法利用Microsoft EXCEL 建立数据库，导入SPSS17.0 软件进行统计分析。计量资料选择t 检验或秩和检验；计数资料选择秩和检验或χ2检验；相关分析采用spearman 等级相关。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 实验组与对照组HER-2 和CyclinD1 的表达情况HER-2 阳性表达主要定位于细胞膜，镜下显示为主要在基底侧膜、侧膜或完全性的细胞膜呈棕黄色，其中部分胞质着色。表1 显示，85 例实验组中有44 例出现阳性表达，阳性率为51.76%；对照组中未见阳性表达，两组间HER-2 蛋白表达情况差异有统计学意义（Z=-8.71，P<0.001）。CyclinD1 阳性表达主要定位于细胞核，实验组85 例PTC 中有70 例出现阳性表达，阳性率为82.35%；对照组无阳性表达，两组CyclinD1 表达情况差异有统计学意义（χ2=119.00，P<0.001）。

表1 实验组和对照组HER-2、CyclinD1蛋白的表达情况

2.2 实验组中HER-2、CyclinD1 蛋白表达的相关情况表2 中显示，实验组中HER-2 与CyclinD1 联合表达情况，85 例中有5 例HER-2 和CyclinD1 蛋白均无表达，两蛋白表达情况无相关性（r=-0.021，P=0.846）。

表2 实验组中HER-2和CyclinD1蛋白的表达情况（n）

表3 不同临床病理参数中HER-2、CyclinD1蛋白的表达情况（n）

2.3 颈部淋巴结转移与HER-2、CyclinD1 蛋白的表达情况其中，性别、年龄、肿瘤直径与两种蛋白的表达无关（P>0.05），PTC 实验组淋巴结转移与HER-2蛋白表达无关（Z=-1.36，P=0.173），但淋巴结转移组CyclinD1 蛋白阳性率（96.43%）高于非转移组（74.47%）（χ2=4.47，P=0.034），详见表3。

3 讨论

近年来，随着分子生物学技术水平的迅速发展，基因突变与甲状腺癌的发生、发展及临床病理学因素的相关性研究已经成为研究热点。

HER-2 蛋白在乳腺癌中表达的检测以及相关药物的治疗已广泛应用于临床，现又逐渐应用于胃癌的检测及治疗中［7］，而该蛋白与PTC 的关联研究较少。本实验通过免疫组化方法对75 例 PTC 进行HER-2 蛋白检测，发现HER-2 蛋白在PTC 中阳性表达多定位于细胞膜的底侧膜或侧膜，部分也存在完全性细胞膜着色。由于尚未有公认的甲状腺癌中HER-2 的判读标准，参考胃癌和乳腺癌的HER-2 判读标准进行，将PTC 中免疫组化检测出的HER-2（++，+++）定为阳性。研究显示，实验组中有39 例患者HER-2 表达阳性，阳性率为51.76%，对照组未见阳性表达，两组间HER-2 蛋白表达情况差异有统计学意义。此结果与张晓亮［7］研究一致。由此推测，HER-2 蛋白的表达是PTC 发生发展的重要因素，可以作为评估PTC 的独立的危险因素，其临床治疗的价值值得进一步深入探讨。

CyclinD1 蛋白是G1 期细胞周期素，可以驱使细胞由G1 期进入S 期，促进细胞增殖。1991 年由 Motokura等在研究甲状旁腺时首先分离该蛋白，并发现正常情况下，CyclinD1 蛋白在G1 期只是呈一过性表达，但当CyclinD1 蛋白表达失控时，则会引起细胞增殖周期失调，导致细胞过度增殖，从而导致肿瘤发生［8］。近年来大量研究证实，CyclinD1 作为候选癌基因已参与多种实体瘤的分子病理机制，是目前公认的癌基因［8-10］。本研究中，85 例PTC 患者中有70 例出现阳性表达，阳性率达到82.35%；对照组无阳性表达，两组间CyclinD1 表达情况差异有统计学意义,研究结果与冯云报道一致［8］。由此推测，CyclinD1 蛋白的异常表达与PTC 密切相关，也可以作为评估PTC 的独立危险因素。

本次研究未发现HER-2 与 CyclinD1 存在显著相关关系，虽然有研究证实HER-2 激活后可以影响CyclinD1 的表达［11］，但是本研究结果显示两者阳性率差别较大（分别为51.76%和82.35%），不存在显著相关关系，因此推测HER-2 只是影响CyclinD1 表达的一个因素，还存在其他未知因素影响CyclinD1 表达。

本次研究通过对性别、年龄、肿瘤直径以及淋巴结转移等基本病理，对两种蛋白表达情况进行比较分析。其中性别、年龄、肿瘤直径与两种蛋白的表达无关，PTC实验组淋巴结转移与HER-2 蛋白表达无关，但淋巴结转移组CyclinD1 蛋白阳性率高于非转移组，与刘泽兵［6］，甘世新［12］等研究报道一致，由此推测过表达CyclinD1 的肿瘤组织更具有侵袭力，淋巴结转移率更高。

本研究结果显示HER-2 蛋白与 PTC 密切相关，CyclinD1 蛋白不仅与 PTC 有关，还与淋巴结转移存在相关关系。因此，研究推测 HER-2 和CyclinD1 蛋白对于PTC 诊断具有一定意义，其临床治疗价值值得进一步深入探讨。两蛋白与PTC 患者颈部淋巴结转移危险因素的评估方面，发现CyclinD1 蛋白的表达与PTC 的颈部淋巴结转移有关，提示CyclinD1 蛋白可能是 PTC淋巴结转移的独立危险因素，CyclinD1 蛋白表达阳性的PTC 患者发生淋巴结转移的可能性越大，而二者的关联需要进一步在大样本人群研究中验证。

［1］ Ronchers CM, Mclarra P, Ron E, et.Thy roid cancer and multiple primary tumors in the SEER canar registri es［J］, Int J Cancer, 2005,117(2): 281-288.

［2］ 冯云, 卢秀波, 李军红, 等.BP1与CyclinD1蛋白在甲状腺乳头状癌中的表达及意义 ［J］.医药论坛杂志, 2013, 34(1): 33-35.

［3］ 方海飞, 沈美萍, 徐银锋.甲状腺乳头状癌TGF-β1、CD31表达与肿瘤转移的关系［J］.南京医科大学学报, 2007M 27(5): 472-475.

［4］ 戴携, 张言涛, 秦琴, 等.HER-2 表达在乳腺癌辅助化疗方案选择中的作用［J］.湖 南师范大学学报(医学版), 2010, 3(1): 22-28.

［5］ Qin C, Cau W, Zhang Y, et al.Correlation of clinicopathological features and expression of molecular markers with prognosis after I131 treatment of differenitiated thyroid carcinoma［J］.Clin Nucl Med, 2012, 37(3):e40-6.

［6］ 刘泽兵, 王丽, 叶宣光, 等.甲状腺乳头状癌组织中E-cadherin、β-catenin和cyclinD1蛋白表达及意义［J］.临床与实验病理学杂志,2011, 27(2): 146-9.

［7］ 张晓亮, 胡向阳, 杨懿, 等.HER-2、CyclinD1在甲状腺乳头状癌中的表达及意义［J］.安徽医科大学学报, 2014, 49(7): 958-962.

［8］ 王前, 邓晶, 蒋永新.cyclinD1的研究进展［J］.现代肿瘤医学, 2009,17(2): 350-353.

［9］ 冯云, 卢秀波, 李军红, 等.BP1与CyclinD1蛋白在甲状腺乳头状癌中的表达及意义 ［J］.医药论坛杂志, 2013, 34(1): 33-35.

［10］ 林军, 应亚君, 瞿海江, 等.CK19、Galectin-3、HBME-1、p27及CyclinD1在甲状腺乳头状癌中的表达及意义［J］.中国癌症杂志,2009, 19(6): 433-438.

［11］ 朱孝峰, 周军民, 谢冰芬, 等.ST2325抑制HER2／neu受体酪氨酸激酶信号转导途 径及其对乳腺癌细胞周期的影响［J］.中国药理学通报, 2005, 20(12): 1361—5.

［12］ 甘世新, 米玉录.p27和cyclinD1与甲状腺乳头状癌颈淋巴结转移的关系［J］.中国 药物与临床, 2010, 10(6): 657-658.