MMP-9 和TGFβ1 在宫颈鳞癌中的表达和意义

沈浩明，杨友义，吴白平，向延娥

（1.湖南省肿瘤医院，长沙 410013；2.湖南师范大学医学院，长沙 41000）

宫颈癌是妇女中常见的恶性肿瘤，每年全世界大约有37 万新发病例，在宫颈癌患者中大约有51%死亡。宫颈癌是妇女死于恶性肿瘤的重要原因之一，是继乳腺癌之后居第二位的恶性肿瘤。因此，宫颈癌是严重危害妇女健康的疾病之一。

恶性肿瘤的侵袭和转移是一个复杂的、多步骤的过程，其中细胞外基质和基底膜的降解被认为是肿瘤侵袭正常组织和开始转移的信号和重要途径。研究表明，细胞外基质和基底膜的重塑是癌细胞侵袭转移过程中的关键环节，需借助蛋白降解酶的表达和激活。已证实与肿瘤侵袭转移有关的基质降解酶有两大类：蛋白酶类和糖苷酶类。目前所知的蛋白降解酶类有丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和基质金属蛋白酶（MMPS）。MMPS 是一组重要的细胞外基质降解酶，它通过对细胞外基质不同成分的降解，在肿瘤的侵袭转移中起重要作用。MMP-9 是MMPS 家族中的重要成员，能降解细胞外基质的主要成分IV 型胶原、纤连蛋白和层粘连蛋白，被认为与肿瘤的侵袭转移密切相关。

转化生长因子β1（TGF-β1）是普遍存在的细胞生长抑制因子，在生理状态下，对细胞增殖、分化、迁移、血管生成、免疫监视等起重要的负性调节作用；而在肿瘤中，TGF-β1 却表现出双重作用，在肿瘤早期，TGF-β1 可抑制肿瘤生长，随着肿瘤的进展，TGF-β1可干扰机体免疫功能，促进肿瘤生长、浸润和转移。TGF-β 1 参与调节基质金属蛋白酶及其抑制因子的表达。HPV 相关的宫颈癌的重要形成机制之一是TGF-β1 的改变，但是目前TGF-β1 在宫颈癌中的表达情况存在争议。

本实验拟采用ELISA 和免疫组化的方法检测宫颈分泌物、血清和宫颈病变组织中的TGF-βl 和MMP-9表达情况，探讨其与宫颈癌临床病理参数之间的关系，并分析几种检测方法的临床应用价值。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

1.1.1 ELISA 试剂与仪器（1）试剂 美国Groundwork Biotechnology Diagnosticate 公司Matrix Metalloproteinase 9 ELISA 试剂盒 （批号：LOT#M064-00 EXP 2011 Mar）美国Groundwork Biotechnology Diagnosticate 公司Transforming Growth Factor β1 ELISA 试剂盒 （批号：LOT#T024-00 EXP 2011 Mar） （2）主要仪器 TDL4-2低速台式离心机（长沙湘仪贝克仪器仪表有限公司）FX1800-II-B2 型生物安全柜（上海瑞仰净化设备有限公司）ELX800 酶标仪（美国伯腾仪器有限公司）及宝特800 酶联系统软件HH·BII·360BS-II 型恒温干燥箱（上海跃进医疗器械厂）HH·W21·Cr600II 型台式电子恒温水温箱（汕头市医用设备厂有限公司）2ul、10ul、50ul、100ul、200ul 移液器各一把（赛默飞世尔上海仪器有限公司）

1.1.2 免疫组化试剂与仪器（1）试剂 鼠抗人MMP-9 单克隆抗体工作液（北京中杉金桥生物技术有限公司货号100301014B 产地北京）鼠抗人TGF-β1 单克隆抗体工作液（北京中杉金桥生物技术有限公司货号100301012B 产地北京）中性树胶（上海华申康复器材有限公司货号20091213 产地上海）多聚赖氨酸（北京中杉金桥生物技术有限公司）SP-9002 鼠SP Kit 试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司货号10050713 产地北京）DAB 显色剂（北京中杉金桥生物技术有限公司）苏木素复染液、二甲苯、乙醇等化学试剂柠檬酸缓冲液（pH6.0）磷酸盐缓冲液（PBS：pH7.4）（2）仪器 石蜡切片机奥林巴斯生物显微镜；病理图文分析系统；推片烤片机；电热恒温箱；电冰箱；其他：不锈钢压力锅、染片缸、染片盒、微量移液器、载玻片及盖玻片等。

1.2 材料来源

1.2.1 血清和宫颈分泌物标本湖南省肿瘤医院66 例妇科肿瘤病房病人宫颈分泌物和血清标本。其中慢性宫颈炎组织10 例、CIN（cervical intraepithelial neoplasia 宫颈上皮内瘤变）24 例，宫颈鳞癌32 例。所有病例术前均未经放疗或化疗。宫颈分泌物采用一次性专用刷，刷取宫颈分泌物保存于0.5 mL 生理盐水中，以1000rpm/min离心后取上清液保存于-70℃冰箱冻存备测。

研究对象均于清晨空腹肘静脉抽血5 mL，静置半小时，于4000 转/分离心5 分钟分离血清，装于干净的聚丙烯管中，贴好标签，置于-70℃冰箱冻存备测。

1.2.2 免疫组化标本收集湖南省肿瘤医院经手术切除的宫颈组织标本，其中慢性宫颈炎组织10 例、 CIN24例，宫颈鳞癌（CxCa）32 例。所有病例术前均未经放疗或化疗，病理诊断均由两名病理医师证实。所有标本均经10%的甲醛固定，常规石蜡包埋，4 um 厚连续切片。

1.3 实验方法

1.3.1 ELISA 实验实验原理：先将抗体包被于酶联板上，同时加入待测标准品、待测样本和酶标的小分子，温育一定时间后，洗板；此步中，待测标准品、待测样本将与酶标小分子竞争与固相上特异抗体结合。加入酶底物，温育，显色测定，显色的强弱与待测样本中的小分子含量成反比。

实验步骤：（1）取出试剂盒，于室温（20~25℃）放置15～30 分钟。（2）取出酶标板，按照标准品的次序分别加入100 μL 的标准品溶液于6 个微孔中（标准品组）。样品组中加入100 μL 的样品，空白对照组加入100 μL 的蒸馏水，孵育并加入酶标抗体反应。（3）用清洗液充分清洗酶标板3~5 次，（4）酶标板洗涤后用吸水纸彻底拍干。（5）各孔加入显色剂A、B 液各50 μL。（6）20~25℃下避光反应15 分钟。（7）各孔加入50 μL 终止液，终止反应。

结果判断：将酶标板于酶标仪检测（采用450 nm 和630 nm 双波长检测）各孔OD 值，运用宝特800 酶联系统软件采用二次曲线拟合方法换算出各孔浓度。

1.3.2 免疫组化实验免疫组织化学染色法采用SP 染色法标本经100 mL/L 福尔马林固定，常规石蜡包埋，连续切片，厚5 μm，并行常规HE 染色经病理科专家阅片复诊。免疫组织学SP 法按试剂盒说明书进行。组织切片脱蜡至水，PBS 缓冲液振洗3 min×3；置于耐高温切片架上，放入已沸腾的高压锅中进行组织抗原热修复，盖上锅盖，扣上压力阀，继续加热至喷气，从喷气开始计时，2 min 后压力锅离开热源，冷却至室温，取出玻片，蒸馏水冲洗两次，PBS 液振洗3 min×3；30 mL/L H2O2去离子水消除内源性过氧化物酶活性，室温下孵育10 min，PBS 缓冲液振洗3 min×3；正常山羊血清封闭，室温孵育15 min；加适当比例稀释的第一抗体，37℃孵育2 h，PBS 缓冲液振洗3 min×3；加生物素标记的第二抗体，37℃孵育15 min，PBS 缓冲液振洗3 min×3；加辣根过氧化物酶标记链霉卵白素工作液，37℃孵育15 min，PBS 缓冲液振洗3 min×3；DAB 显色，苏木素浅染，脱水，封片，镜检。

结果判断：TGF-β1 阳性表达为细胞胞膜和（或）胞浆上呈现深棕色颗粒；MMP-9 阳性表达为细胞浆中呈现棕色或深棕色颗粒。采用半定量结果判断，阳性着色强度：无色为0 分，淡黄色为1 分，棕黄色为2 分，棕褐色为3 分；阳性着色细胞数：每张切片上观察5 个高倍视野（×200），计数阳性细胞百分比，阳性细胞数≤10%为1 分，11%-50%为2 分，51%-100%为3 分。将着色强度与阳性细胞百分比分值相加，0-2 分为阴性（-），3分为弱阳性（+），4 分为轻度阳性（++），5-6 分为（+++）。

1.4 统计学分析利用SPSS16.0 进行单因素方差分析比较多组均数的差异，并进行相关与回归分析判断TGF-β1 与MMP-9 表达的相关性。

2 结果

2.1 慢性宫颈炎、CIN 组和CxCa 组患者血清和宫颈分泌物标本MMP-9 和TGF-β1 含量的ELISA 检测结果宫颈分泌物中MMP-9 在慢性宫颈炎、CIN 组和CxCa 组的平均浓度分别为1.28±0.34ng/ mL、2.44±0.68ng/ mL 和8.05±1.09ng/ mL，CIN 组和CxCa 组与慢性宫颈炎相比明显升高，（P<0.01），而CxCa 组与CIN 组相比，宫颈分泌物中MMP-9 的表达也明显升高（8.05±1.09ng/ mL vs 2.44±0.68ng/ mL，P<0.01），表明随着宫颈癌恶性程度的增加，MMP-9 的表达明显增强。而血清中MMP-9 在慢性宫颈炎、CIN 组和CxCa 组的平均浓度分别为6.42±0.82ng/ mL，7.25±1.02ng/ mL 和13.76+2.98ng/ mL，各组间的MMP-9 表达在统计学上有显著差异（P<0.01），表明随着宫颈癌恶性程度的增加，MMP-9 的表达明显增强，而且可以看出在宫颈分泌物中MMP-9 的平均浓度增高更为明显。

宫颈分泌物中TGF-β1 在慢性宫颈炎、CIN 组和CxCa 组的平均浓度分别为47.7±8.32pg/ mL、100.3±17.98pg/ mL 和243.3±27.62pg/ mL，CIN 组和CxCa 组与慢性宫颈炎相比统计学上有显著差异（P<0.01），而CxCa 组与CIN 组相比，宫颈分泌物中的TGF-β1 表达也明显升高（243.3±27.62pg/ mL vs 100.3±17.98pg/mL，P<0.01），表明随着宫颈癌恶性程度的增加，TGF-β1 的表达与MMP-9 一样明显增强。而血清中TGF-β 1 在慢性宫颈炎、CIN 组和CxCa 组的平均浓度分别为202.3±13.70pg/ mL，237.4±26.88pg/ mL 和366.2±21.50pg/ mL，各组间的TGF-β1 表达水平在统计学上有显著差异（P<0.01），表明随着宫颈癌恶性程度的增加，TGF-β1 表达明显增强，而且可以看出在宫颈分泌物中TGF-β1 的平均浓度增高更为明显。

表1 慢性宫颈炎、CIN和CxCa患者宫颈分泌物和血清中MMP-9和TGF-β1的表达

2.2 慢性宫颈炎、CIN 组和CxCa 组患者宫颈组织样本MMP-9 和TGF-β1 表达的免疫组化结果MMP-9 阳性率从慢性宫颈炎组（图1C）、CIN 组（图1B）到CxCa 组逐级升高（图1A），66 例样品的统计结果见表2，并且利用ELISA 方法检测的宫颈分泌物中MMP-9浓度与其切片免疫组化阳性率的基本吻合，两种检测方法都显示出，随着宫颈癌恶性程度的增加，MMP-9的表达明显增强。

图1 MMP-9阳性率从慢性宫颈炎组、CIN组到CxCa组逐级升高

图2 TGF-β1阳性率从慢性宫颈炎组、CIN组到CxCa组逐级升高

表2 MMP-9在慢性宫颈炎组、CIN组和宫颈癌组中的表达情况

Chi-squre=13.14 P=0.0014 ＜0.01，认为免疫组化检测组织中mmp-9 水平在慢性宫颈炎组、CIN 组和宫颈癌组中的表达有显著差异，并且阳性率逐级增高。

利用TGF-β1 特异性抗体进行免疫组化的结果显示，表达TGF-β1 的细胞从慢性宫颈炎组（图2C）、CIN组（图2B）到CxCa 组逐级升高（图2A），66 例样品的统计结果见表3，并且利用ELISA 方法检测的宫颈分泌物中TGF-β1 浓度与其切片免疫组化阳性率的基本吻合，两种检测方法都显示出，随着宫颈癌恶性程度的增加，TGF-β1 的表达明显增强。

表3 TGFβ1在慢性宫颈炎组、CIN组和宫颈癌组中的表达水平

Chi-squre=15.82 P=0.0004 ＜0.01 认为免疫组化检测组织中TGF-β1 水平在慢性宫颈炎组、CIN 组和宫颈癌组中的表达有显著差异，并且阳性率逐级增高。

2.3 MMP-9 和TGF-β1 在宫颈分泌物和血清中表达的相关性在前面的结果中显示TGFβ1 与MMP-9 的表达均随着肿瘤恶性化程度逐级升高，提示TGF-β1和MMP-9 的表达可能存在一定的联系，综合分析66个样品的TGF-β1 和MMP-9 的表达之间的相关性（不考虑分组）。图3 显示的是66 例样品中宫颈分泌物TGF-β1 表达情况，图4 显示的是66 例样品中宫颈分泌物MMP-9 表达情况，对宫颈分泌物中的TGF-β1 与MMP-9 表达水平进行相关性分析，结果显示两者呈显著的正相关（图5），相关系数（r）=0.374，P<0.01。

利用同样的方法分析血清中TGF-β1 与MMP-9 的表达的相关性，图6 显示的是66 例样品中血清TGF-β1表达情况，图4 显示的是66 例样品血清中MMP-9 表达情况，对血清的TGF-β1 与MMP-9 表达水平进行相关性分析，结果显示血清中TGF-β1 与MMP-9 表达水平同样具有显著的正相关（图5），相关系数（r）=0.643，P<0.01。

图3 66例样品宫颈分泌物中TGFβ1的表达水平

图4 66例样品宫颈分泌物中MMP-9的表达水平

图5 宫颈分泌物中TGF-β 1与MMP-9表达的相关性曲线

图6 66例样品血清中TGF-β1的表达水平

图7 66例样品血清中MMP-9的表达水平

图8 血清中TGF-β1与MMP-9表达的相关性曲线

2.4 MMP-9 和TGF-β1 与宫颈癌各临床病理因素的关系（表4）分析32 例宫颈癌标本（CxCa 组）中MMP-9 和TGF-β1 表达情况与宫颈癌各临床病理因素的关系，研究涉及的临床病理因素包括肿瘤大小、组织学分级、有无淋巴转移以及临床分级等。结果如表4 所示，其中TGF-β1 表达阳性率在肿瘤大小<5CM的样品与肿瘤大小>5CM 的标本中，没有显著性差异（57.1% vs 66.6%，P>0.05），MMP-9 表达阳性率在肿瘤大小不同组中也不具有显著的差异（71.4% vs 61.1%，P>0.05）。在组织学分级不同的组中，TGF-β 1 或MMP-9 表达阳性率也没有显著性的差异（P>0.05）。但是对于无淋巴结转移的标本，其TGF-β1 的表达阳性率显著低于有转移的组（50% vs 86.4%，P<0.05），并且在两组中MMP-9 表达的阳性率变化与TGF-β1 一致。在宫颈癌≥Ⅱb 期的TGFβ1 和MMP-9 的表达阳性率显著高于≤Ⅱa 期的（TGF-β1：82.6% vs 44.4%，P<0.05；MMP-9：87% vs 55.5%，P<0.05）。

综合以上结果，可以看出宫颈癌标本（CxCa 组）中MMP-9 和TGF-β1 表达情况与淋巴结转移以及癌症临床分期具有一定的联系，MMP-9 和TGF-β1 表达可能促进淋巴结转移以及肿瘤进一步恶化，MMP-9 和TGF-β1表达检测可能成为监测宫颈癌浸润和转移的重要指标。

表4 MMP-9和TGF-β1与宫颈癌各临床病理因素的关系

3 讨论

宫颈癌（cervical carcinoma）是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一。一般认为其发生是宫颈上皮内瘤变（CIN）至宫颈癌的连续过程。在肿瘤侵袭转移过程中，肿瘤细胞能与基底膜（BM）表面受体结合，释放各种水解酶降解细胞外基质（extracelluiar matrix，ECM），瘤细胞伸出伪足并向被蛋白酶降解的区域运动，从而形成转移灶。基质金属蛋白酶（MMP）是一种重要的ECM 降解酶，甚至在BM 未被降解和未出现恶性病变时，肿瘤组织中已发现MMP 的表达上调并活化［1］。基质金属蛋白酶-9（MMP-9）是MMP 家族中的重要一员。宫颈癌中TGF-β1 的表达说法不一，但大多数研究表明，TGF-β1 在宫颈癌中呈现过度表达。Hazelbag 等［2］和Farley 等［3］的研究都发现宫颈癌中TGF-β1 过度表达。

3.1 基质金属蛋白酶-9（MMP-9）简介及其作用基质金属蛋白酶是一个大家族，因其需要Ca++、Zn++等金属离子作为辅助因子而得名，其家族成员具有相似的结构，一般由5 个功能不同的结构域组成：（1）疏水信号肽序列；（2）前肽区，主要作用是保持酶原的稳定。当该区域被外源性酶切断后，MMPs 酶原被激活；（3）催化活性区，有锌离子结合位点，对酶催化作用的发挥至关重要；（4）富含脯氨酸的铰链区；（5）羧基末端区，与酶的底物特异性有关。其中酶催化活性区和前肽区具有高度保守性［8］。MMPs 成员上述结构的基础上各有特点。各种MMP 间具有一定的底物特异性，但不是绝对的。同一种MMP 可降解多种细胞外基质成份，而某一种细胞外基质成分又可被多种MMP 降解，但不同酶的降解效率可不同。MMPs 几乎能降解ECM 中的各种蛋白成分，破坏肿瘤细胞侵袭的组织学屏障，在肿瘤侵袭转移中起关键性作用，从而在肿瘤浸润转移中的作用日益受到重视，被认为是该过程中主要的蛋白水解酶。目前MMPs家族已分离鉴别出26 个成员，编号分别为MMP1～26。根据作用底物以及片断同源性，将MMPs 分为4 类。Ⅳ型胶原酶为其中重要的一类，它主要有两种形式，一种被糖化，分子量为92kD，命名为MMP-9［9］。

MMP-9 又称Ⅳ型胶原酶或明胶酶B，是由多种细胞分泌的糖化蛋白。人类MMP-9 在MMP 家族中分子量最大，其基因位于染色体20ql2-q13。MMP-9 基因的正常表达能调控和维持正常组织功能。MMP-9 在多种恶性肿瘤中呈过度表达［4］，其调控作用消失，可能成为肿瘤细胞发生侵袭转移的原因。肿瘤转移过程中，MMP-9 通过降解ECM，形成局部溶解区，构成肿瘤细胞移动的通道［5］。此外，肿瘤细胞产生的MMP-9，还参与肿瘤的血管生成［6］。MMP-9 在降解BM 糖蛋白及ECM 的同时能对ECM 进行改建，为新的血管生长提供空间，有助于新的血管形成［7］。随MMP-9 表达的增强，肿瘤的血管生成能力显著增加［8］。

3.2 MMP-9 与恶性肿瘤恶性肿瘤的发生与发展是一个复杂的过程。MMPs 在肿瘤转移中有如下作用：第一，破坏局部组织结构，促进肿瘤生长；第二，破坏基底膜屏障，有利于肿瘤的转移；第三，通过对细胞外基质的改建，促进肿瘤新生血管的形成。肿瘤发生浸润和转移的先决条件是对其周边细胞外基质和基底膜降解。基底膜是肿瘤细胞侵袭和转移的屏障，其完整性是判定肿瘤细胞有无浸润和转移的标志。肿瘤通过降解基底膜的IV 型胶原、层粘连蛋白、纤粘连蛋白质直接侵袭临近正常组织或穿过血管到达靶器官，在转移部位呈恶性增生。有关文献报道，水解IV 型胶原的MMP-9-在这一过程中起及其重要作用。Kabashima等［13］，报道，胃粘膜内癌组织中MMP-9 的表达与癌细胞在淋巴管中的扩散及淋巴结的转移高度相关，推测MMP-9 在肿瘤细胞的转移行为方面起关键性作用。Demeter 等［14］，研究了17 例上皮性卵巢癌，5 例良性卵巢肿瘤，5 例正常卵巢组织，5 例低度潜在恶性卵巢肿瘤，4 例性索间质瘤以及2 例生殖细胞肿瘤，发现MMP-9 活性不存在于正常卵巢，上皮性卵巢癌MMP-9 水平高于良性卵巢肿瘤，MMP-9 活性在分化低、分期高的卵巢癌中表达明显增高，同时发现复发性卵巢癌中MMP-9 明显升高，说明MMP-9 高表达与临床分期有关，且与患者预后密切相关。Sh-eu 等［15］采用免疫组织化学法研究发现，随着宫颈癌病变程度的加重，MMP-9 的表达量不断增加，且与淋巴结的转移和肿瘤复发有关。另外，在肝癌［16］、乳腺癌［18］、骨肉瘤［17］等多种恶性肿瘤中均发现MMP-9 的高表达，且在临床分期晚，组织分级低，淋巴结转移阳性的肿瘤中表达异常增高，MMP-9 可能与肿瘤的侵袭能力和恶性表型有关。

3.3 MMP-9 的表达与宫颈癌的关系MMP-9 在宫颈癌中的表达位于癌细胞的细胞浆［9-11］和／或细胞膜［11］，并且在癌细胞向间质浸润最明显处表达最强［9］，有的在宫颈癌周围间质成纤维细胞中由弱到中度阳性表达［9］。MMP-9 在宫颈癌中的表达高于宫颈炎组织与CIN 组，且随着病程不断进展及病理分级的增加表达率呈上升趋势［9］。关于MMP-9 表达率与宫颈癌癌细胞的分化程度的关系，文献报道较不一致。有报道称MMP-9 的表达率在高、中、低分化宫颈癌中无显著性差异［10］，同时也有报道称宫颈癌高分化组的MMP-9 的表达率明显低于中低分化组［11］。MMP-9 的表达率与宫颈癌的转移有关［12］。

3.4 TGF-β1 的表达和宫颈癌的关系宫颈癌中TGF-β1 的阳性率比CIN 组和宫颈炎组显著增高，提示TGF-β1 的高表达与宫颈癌密切相关。可能因为宫颈癌细胞对高水平TGF-β 1 的生长抑制效应产生耐受，敏感性降低。而癌细胞自身分泌的TGF-β1 又增加了局部免疫抑制作用，使肿瘤细胞逃避免疫监控。同时TGF-β1 的阳性率随宫颈癌临床分期的进展而增高，而且TGF-β1 在有淋巴结转移的宫颈癌中的阳性率显著增高。另外随着病理分级的增高，TGF-β1 的表达也逐渐增高。提示机体对TGF-β1 的抑制产生耐受后不仅不能抑制癌细胞生长，反而促进其生长，并增加恶性程度，促进细胞的侵袭和转移。可见TGF-β1的过度表达导致了信号传导通路的紊乱，使TGF-β1的抑制作用基本丧失。高水平的TGF-β1 在肿瘤局部“小环境”里积聚，甚至通过某种机制转而促进肿瘤生长。我们认为血清和宫颈分泌物TGF-β1 升高提示宫颈癌恶性程度的增加。

3.5 MMP-9 和TGF-β1 与宫颈癌的关系TGF-β1是MMP-9 的重要调节因子，其可在基因水平、酶原水平和组织抑制剂水平调控MMP-9 表达、分泌和活性，而TGF-β 1 活化也涉及到MMP-9 的酶解，可见TGF-β 1 和MMP-9 之间相互协调、相互制约，共同调控着肿瘤的进展。本研究结果显示，随着宫颈癌临床分级的增加血清中和宫颈分泌物中的TGF-β 1 是MMP-9 程明显上升趋势，且与相应病理切片所作的TGF-β1 和MMP-9 的免疫组化结果吻合。

综上所述，TGF-β1 在宫颈癌发生发展过程中影响着MMP-9 的表达，两者均发挥促进肿瘤浸润、转移的功能。

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