木醋杆菌合成细菌纤维素增效因子的筛选

常冬妹，卢红梅 *，陈 莉，张丽平，杨凤仪，贾青慧

（1.贵州大学 贵州省发酵工程与生物制药重点实验室，贵州贵阳 550025；2.贵州大学 酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳 550025；3.贵州大学 化学与化工学院，贵州 贵阳 550025）

细菌纤维素（bacterial cellulose，BC）是由D-葡萄糖单体以β-1,4糖苷键连接而成的直链多糖，直链之间彼此呈平行状，不呈螺旋结构，没有分支结构[1]。细菌纤维素具有纯度高、结晶度高、聚合度高、可降解、超细性（纳米级）及生物适应性等优良性能[2]。在众多产生纤维素的细菌中，木醋杆菌是最早发现也是研究较为透彻的纤维素产生菌，是已知合成纤维素能力最强的微生物菌种。近年来随着科技的进步以及人们对细菌纤维素本质以及合成机理的更深入了解[3]，细菌纤维素作为一种新型的生物材料已经广泛的应用于食品、造纸、医学材料、声音振动膜等多个领域[4]。但由于其产量较低且生产成本高，极大地制约了细菌纤维素工业化推广应用[5]。

目前，国内外对细菌纤维素研究的重点集中在细菌纤维素产量的提高和改性研究方面，而提高细菌纤维素产量的途径主要包括选育高产菌株、优化工艺条件、改进发酵方式与探讨代谢机理等[6]。本研究选择相对较多的玉米浆、Tween-80、羧甲基纤维素（carboxy methylated cellulose，CMC）、海藻酸钠、咖啡因、烟酸、生物素以及工业化生产原料的典型代表椰子水作为增效剂，研究8种增效剂对木醋杆菌产细菌纤维素的增效作用，在合成细菌纤维素过程中单一添加八种物质，并筛选出对实验室保藏的木醋杆菌（Acetobacter xylinus）合成细菌纤维素有增效作用的物质，以产量为指标测定每一种增效物质的最适添加量。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种及材料

木醋杆菌（Acetobacter xylinum）：贵州大学贵州省发酵工程与生物制药重点实验室保藏；椰子汁：市售椰子破壳取汁液，于冰箱（4 ℃）中保藏；玉米浆：市售。

1.1.2 试剂

氢氧化钠（分析纯）：重庆茂业化学试剂有限公司；烟酸（分析纯）：重庆川江化学试剂厂；无水乙醇（分析纯）：天津市富宇精细化工有限公司；海藻酸钠（分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；咖啡因（分析纯）：阿拉丁试剂；羧甲基纤维素（分析纯）、Tween-80（分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；生物素（分析纯）：河南天兴食品添加剂有限公司。

1.1.3 培养基

斜面培养基：葡萄糖20.0 g/L，蛋白胨5.0 g/L，酵母膏5.0 g/L，柠檬酸1.0 g/L，磷酸氢二钠2.0 g/L，琼脂20.0 g/L，蒸馏水1 000 mL，121 ℃灭菌20 min。

木醋杆菌液体种子培养基[7]：蔗糖20.0 g/L，酵母膏5.0 g/L，蛋白胨5.0 g/L，磷酸二氢钾2.0 g/L，硫酸镁1.0 g/L，无水乙醇3.0%，蒸馏水1 000 mL，pH 6.8，121 ℃灭菌20 min。

基础培养基：蔗糖50.0 g/L，酵母膏10.0 g/L，蛋白胨8.0 g/L，磷酸二氢钾4.3 g/L，硫酸镁2.5 g/L，蒸馏水1 000 mL，pH 7.2，121 ℃灭菌20 min。

添加物培养基：根据基础培养基配方称取所需量的8种增效物质，用蒸馏水配制。

发酵培养基：蔗糖50.0 g/L，蛋白胨15.0 g/L，柠檬酸2.0 g/L，Na2HPO·412H2O 2.0 g/L，KH2PO42.0 g/L，无水乙醇10.0 mL，MgSO4·7H2O 0.3 g/L，蒸馏水1 000 mL，pH 6.8，121 ℃灭菌20 min。

1.2 仪器与设备

SPX-250型生化培养箱：上海悦丰仪器仪表有限公司；HH-b型数显恒温水浴锅：常州奥华仪器有限公司；101-1型电热鼓风干燥箱：北京科伟永兴仪器有限公司；FA2004N型精密电子天平：上海菁海仪器有限公司；YXQ-LS-50SI型立式压力蒸汽灭菌器：上海博迅实业有限公司医疗设备厂。

1.3 方法

1.3.1 培养方法

菌种的活化：挑取适量原代木醋杆菌转接至木醋杆菌斜面培养基中，在28 ℃条件下静置培养72 h。

种子液培养：准确量取50 mL液体种子培养基于250 mL的三角瓶中，121 ℃灭菌20 min，冷却后先无菌地在液体种子培养基中加入无水乙醇3%，再接入活化的木醋杆菌三环，置于28 ℃、100 r/min条件下摇床培养24 h。

静态发酵培养：准确量取50 mL发酵培养基于250 mL三角瓶中，121 ℃灭菌20 min，冷却后接入木醋杆菌种子液8%，置于30 ℃条件下静置培养192 h。

增效因子的筛选：分别在基础培养基中单一加入一定比例的8种物质，添加量如表3所示，以接种量8%置于30 ℃条件下静置培养8 d，对细菌纤维膜进行处理和产量的测定。

表1 增效因子添加量优化因素与水平Table 1 Factors and levels of synergistic factor addition

1.3.2 细菌纤维素的处理

收集细菌纤维素膜，用蒸馏水反复冲洗除去膜表面的培养基及杂质后，置于80 ℃，0.1 mol/L的NaOH溶液中，维持2 h以除去菌体蛋白和残余的培养基，至膜呈乳白色半透明状，冷却后用0.1 mol/L HCI中和30 min，自来水充分洗涤，直至呈中性，80 ℃干燥至质量恒定[8]。

1.3.3 细菌纤维素产量测定

将处理过的细菌纤维素膜烘干后称其干质量，BC产量的计算公式如下[9]：

2 结果与分析

2.1 椰子汁添加量对细菌纤维素产量的影响

图1 椰子汁添加量对细菌纤维素产量的影响Fig.1 Effect of coconut juice addition on bacterial cellulose production

分别在50 mL基础培养基中加入0、10 mL、20 mL、25 mL、30 mL、40 mL和50 mL的椰子汁，30 ℃条件下静态发酵培养8 d，对细菌纤维素进行产量测定。不同椰子汁添加量对细菌纤维素产量影响结果如图1所示。

由图1可知，随着椰子汁添加量的增大，细菌纤维素的产量也不断增加。在椰子汁添加量为0～50%时，木醋杆菌产细菌纤维素的量随椰子汁添加量的增长迅速增长；椰子汁添加量＞50%之后增长缓慢；当椰子汁添加为80%时，细菌纤维素的产量最高为6.282 g/L，是空白实验组细菌纤维素产量（1.498 g/L）的4.19倍，说明椰子汁对细菌纤维素的产量有明显的增效作用[10]。因此综合考虑确定椰子水的最适添加量为60%，此时细菌纤维素产量为6.008 g/L。

2.2 玉米浆添加量对细菌纤维素产量的影响

分别在50 mL基础培养基中加入发酵液总体积0、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL、7 mL、8 mL、9 mL和10 mL的玉米浆，30 ℃条件下静态发酵培养8 d，对细菌纤维素进行产量测定。不同玉米浆添加量对的细菌纤维素产量的影响结果如图2所示。

图2 玉米浆添加量的细菌纤维素产量的影响Fig.2 Effect of corn steep liquor addition on bacterial cellulose production

由图2可知，随着玉米浆添加量的增加，细菌纤维素的产量总体趋势呈现先增长后降低的趋势，当玉米浆添加量为10%时，细菌纤维素的产量最高，为8.534 g/L，是空白组的5.67倍。这可能是由于一定量玉米浆中丰富的营养成分利于木醋杆菌的生长繁殖[11]，且玉米浆可以提高发酵培养基的缓冲能力，减缓发酵液pH值降低的速度，使其维持在一个有利于木醋杆菌合成细菌纤维素的环境，但是过量的玉米浆会使发酵液内某些不利于菌体生长繁殖的物质累积，从而抑制了木醋杆菌合成细菌纤维素的进行[12]，因此确定玉米浆的最适添加量为10%。

2.3 咖啡因添加量对细菌纤维素产量的影响

在50 mL基础培养基中分别加入0、0.05 mg、0.10 mg、0.15 mg、0.20 mg、0.25 mg和0.30 mg的咖啡因，30 ℃条件下静态发酵培养8 d，对细菌纤维素进行产量测定，不同咖啡因添加量对细菌纤维素产量的影响结果如图3所示。

由图3可知，当不添加咖啡因时，细菌纤维素产量最高为1.498 g/L。随着咖啡因添加量的增加，细菌纤维素的产量出现小范围的波动，分析可能由于咖啡因在一定范围内抑制磷酸二酯酶的活性，使环状鸟苷酸增加，而环状鸟苷酸是纤维素合成酶的激活剂，从而使纤维素产量增加[13]，但产量均低于不添加咖啡因时所合成的细菌纤维素，这说明咖啡因对于木醋杆菌合成细菌纤维素有抑制作用。

图3 咖啡因添加量对细菌纤维素产量的影响Fig.3 Effect of caffeine addition on bacterial cellulose production

2.4 Tween-80对细菌纤维素产量的影响

分别在50 mL基础培养基中加入0、0.01 g、0.02 g、0.03 g、0.04 g、0.05 g和0.06 g Tween-80，30 ℃条件下静态发酵培养8 d后对细菌纤维素进行产量测定，不同添加量Tween-80对细菌纤维素产量的影响结果如图4所示。

图4 Tween-80添加量对细菌纤维素产量的影响Fig.4 Effect of Tween-80 addition on bacterial cellulose production

由图4可知，随着Tween-80添加量的增加，细菌纤维素产量有先增加后下降的趋势。当Tween-80添加量为0.8 g/L时细菌纤维素产量达到最高2.256 g/L，是产量为1.508 g/L的空白实验的1.5倍。这可能是因为Tween-80作为一种表面活性剂可以影响细胞膜的透性，有利于细菌纤维素的合成，但当添加量过大时会对细胞膜造成损伤影响菌体的正常生长代谢，从而不利于细菌纤维素的合成[14]，所以Tween-80对细菌纤维素产量有明显增效作用且确定Tween-80的最适添加量为0.8 g/L。

2.5 羟甲基纤维素（CMC）对细菌纤维素产量的影响

分别在50 mL基础培养基中加入0、0.1 g、0.2 g、0.3 g、0.4 g、0.5 g和0.6 g的CMC，30 ℃条件下静态发酵培养8 d，之后对细菌纤维素膜进行产量测定，不同CMC添加量对细菌纤维素产量的影响结果如图5所示。

图5 CMC添加量对细菌纤维素产量的影响Fig.5 Effect of CMC addition on bacterial cellulose production

由图5可知，细菌纤维素的产量随着CMC添加量的增大呈现先增加后略降低的趋势，当CMC添加量为4 g/L时，细菌纤维素的产量最高为2.044 g/L，是空白实验组产量（1.504 g/L）的1.36倍。这可能是因为CMC在发酵过程中可部分被降解作为碳源物质被木醋杆菌利用，同时CMC可以改变BC聚合方式，并增加培养基的黏度，利于菌体的生长代谢，可以更充分的利用营养物质。但当CMC的添加量过大时，培养基的黏度过大，不利于菌体的生长繁殖和代谢过程，细菌纤维素的产量反而较低，所以选择CMC的最适添加量为4 g/L。这与朱青梅等[15]用CMC发酵生产改性纤维素的研究结果当CMC的添加量为6 g/L时，细菌纤维素的产量高达10.41 g/L存在很大差距，可能是因为朱青梅等选用的基础培养基为椰子水培养基，基础产量就很高。

2.6 海藻酸钠对细菌纤维素产量的影响

在50 mL基础培养基中分别加入0、0.1 g、0.2 g、0.3 g、0.4 g、0.5 g的海藻酸钠，30 ℃条件下静态发酵培养8 d，之后对细菌纤维膜进行产量测定。不同添加量海藻酸钠对细菌纤维素产量的影响结果如图6所示。

图6 海藻酸钠添加量对细菌纤维素产量的影响Fig.6 Effect of sodium alginate addition on bacterial cellulose production

由图6可知，在海藻酸钠添加量为2 g/L时，细菌纤维素产量达到最高1.548 g/L，此时空白组细菌纤维素产量为1.514 g/L，增效作用并不明显。之后随着海藻酸钠添加量的增多，海藻酸钠对木醋杆菌合成细菌纤维素不但没有促进作用，反而使细菌纤维素的产量快速降低。原因可能是因为Na+的作用。

2.7 烟酸对细菌纤维素产量的影响

分别在50 mL基础培养基中加入0、0.025 mg、0.05 mg、0.075 mg、0.1 mg、0.125 mg、0.150 mg的烟酸，30 ℃条件下静态发酵培养8 d，之后对细菌纤维膜进行产量测定。不同添加量烟酸对细菌纤维素产量的影响结果如图7所示。

图7 烟酸添加量对细菌纤维素产量的影响Fig.7 Effect of niacin addition on bacterial cellulose production

由图7可知，随着烟酸的添加量不断增加，细菌纤维素的产量呈现先急剧增加后缓慢降低的趋势，当烟酸的添加量低于1.0 mg/L的时候细菌纤维素的产量随着烟酸添加量的增大而增大，当添加量高于1.0 mg/L的时候细菌纤维素的产量反而有缓慢的开始降低，在1.0 mg/L时细菌纤维素的产量最高为2.842 g/L，是空白实验组的产量1.512 g/L的1.88倍。这可能是由于烟酸作为维生素B族的一种为辅酶Ⅰ（NAD）和辅酶Ⅱ（NADP）的直接前体，在微生物代谢中起重要作用，有利于木醋杆菌细胞的生长和代谢产物的合成[16]，因此选择烟酸的最适添加量为1.0 mg/L。

2.8 生物素对细菌纤维素产量的影响

在50 mL基础培养基中分别加入0、0.75 mg、1.00 mg、1.25 mg、1.50 mg、1.75 mg和2.00 mg的生物素，30 ℃条件下静态发酵培养8 d，之后对细菌纤维膜进行产量测定。不同添加量生物素对细菌纤维素产量的影响结果如图8所示。

由图8可知，随着生物素添加量的不断增加，细菌纤维素的产量呈现先增加后降低的趋势，当生物素添加量为25 mg/L的时候细菌纤维素产量最高为3.118 g/L，是空白试验组的细菌纤维素产量（1.515 g/L）的2.06倍，增效作用明显。这可能是由于生物素也称维生素H，是丙酮酸羧化酶的辅酶，该酶与三羧酸循环（tricarboxylicacidcycle，TCA）和糖异生作用相关，适量的生物素可以加快草酰乙酸产生的速度，从而可以促进木醋杆菌合成细菌纤维素。因此选择生物素的最适添加量为25 mg/L。

图8 生物素添加量对细菌纤维素产量的影响Fig.8 Effect of biotin addition on bacterial cellulose production

3 结论

以基础培养基培养木醋杆菌合成细菌纤维素时，细菌纤维素的产量比较低，在所选取的椰子水、玉米浆、咖啡因、Tween-80、CMC、海藻酸钠、烟酸、生物素分别添加到基础培养基培养木醋杆菌合成细菌纤维素，结果证实，椰子水、玉米浆、Tween-80、CMC、烟酸和生物素这六种物质对于木醋杆菌合成细菌纤维素有促进作用，作用大小为玉米浆＞椰子水＞生物素＞烟酸＞Tween-80＞CMC，因此，玉米浆可以作为工业化生产细菌纤维素的原料，海藻酸钠的增效效果并不明显，而咖啡因有一定的抑制作用。

结果表明，椰子水、玉米浆、Tween-80、CMC、烟酸和生物素这六种具有增效作用的物质的最适添加量分别为椰子汁60%、玉米浆10%、Tween-80 0.8 g/L、CMC 4 g/L、烟酸1.0 mg/L、生物素25 mg/L，在此添加量下的细菌纤维素产量分别为6.008 g/L、8.534 g/L、2.256 g/L、2.044 g/L、2.842 g/L、3.118 g/L。在已确定的最适添加量基础上，可进一步对相同增效机理和不同增效机理的物质进行复配，以细菌纤维素的产量为衡量指标，确定复配的最佳组合，探究更好的增效方案。

[1]RADIMAN C,YULIANI G.Coconut water as a potential resource for cellulose acetate membrane preparation[J].Polym Int,2008,57(3):502-508.

[2]BACKDAHL H,HELENIUS G,BODIN A,et al.Mechanical properties of bacterial cellulose and interactions with smooth muscle cells[J].Biomatirials,2006,27(9):2141-2149.

[3]黄 莉，王英男，夏秀芳，等.细菌纤维素的基本特性与其应用[J].包装与食品机械，2013，16（5）：60-63.

[4]贾士儒，刘 淼，薄 涛.细菌纤维素的研究及其应用[J].齐鲁工业大学学报，2013，27（3）：9-14.

[5]杨 颖，贾静静，陆胜民.细菌纤维素高产菌株的鉴定及产物分析[J].中国食品学报，2012，12（7）：216-221.

[6]张丽平，卢红梅，彭湘屏，等.淋浇发酵法生产细菌纤维素的结构与性质研究[J].食品工业科技，2012，22（33）：197-201.

[7]CHENG K C,CATCHMARK J M,DEMIRCI A.Effect of different additives on bacterial cellulose production byAcetobacter xylinumand analysis of material property[J].Cellulose,2009,16(6):1033-1045.

[8]崔思颖，朱明军，邓毛程，等.不同培养方式制备的细菌纤维素性质的比较[J].造纸科学与技术，2010，29（1）：67-70.

[9]彭湘屏，卢红梅.不同途径提高细菌纤维素产量的比较[J].中国酿造，2010，29（10）：148-150.

[10]王志国，钟春燕，王锡彬，等.椰子水自然发酵条件对细菌纤维素生产的影响[J].中国酿造，2009，28（4）：32-34.

[11]李 斌，钟春燕，王锡彬.椰子水与菠萝汁生产细菌纤维素的对比研究[J].中国酿造，2014，33（6）：27-30.

[12]李 飞，陈 琳，唐晓燕，等.以玉米浆和木薯为原料机械搅拌发酵制备细菌纤维素的研究[J].工业微生物，2014，44（2）：7-13.

[13]张凤清，张海悦，彭 悦，等.玉米浆做Acetobacter xylinum培养基生产纤维素的发酵条件优化[J].工业技术，2005，26（2）：107-111.

[14]邓毛程，吴亚丽.表面活性剂对木醋杆菌产细菌纤维素的影响[J].食品研究与开发，2008，29（7）：32-34.

[15]朱清梅，冯玉红，林 强，等.利用椰子水生物合成CMC 改性细菌纤维素[J].精细化工，2010，27（7）：654-658.

[16]周伶俐，孙东平，吴清杭，等.Acetobacter xylinumNUST4 合成细菌纤维素发酵条件的优化[J].微生物学通报，2005，32（6）：96-99.