白银市番茄黄化曲叶病毒的鉴定

2015-04-22李春雷文朝慧王溪桥

甘肃农业科技 2015年3期

李春雷，文朝慧，王溪桥，尤佳

（甘肃出入境检验检疫局综合技术中心，甘肃兰州 730010）

番茄（Solanum lycopersicum Mill.）属茄科番茄属，是世界上最重要的蔬菜作物之一［1］。番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）是一种双生病毒（geminiviruses）病害，以烟粉虱作为传播媒介［2］。其大面积爆发对经济发展造成了不同程度的破坏［3～6］。据不完全统计，目前我国番茄黄花曲叶病毒病年发生面积超过6.7万hm2，年经济损失至少20亿元［7］。2011年，甘肃省武山县首次发现TYLCV，2012年，相继在武威市凉州区、民勤县的日光温室发现TYLCV，并于2013年在武威市设施番茄主产区开始流行蔓延，造成严重损失［8～10］。鉴于此，我们对发生于白银市的疑似TYLCV样品进行分子鉴定，并进行了序列同源性比对及系统发育关系的分析，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 实验材料

在甘肃白银市水川镇张庄村选取上部叶片黄化、边缘向上卷曲、植株生长变缓甚至停滞，矮化变小，具有典型黄化曲叶病毒病症状的番茄叶片。DNA提取试剂盒（PlantGenomic DNA Extraction Kit）购自天根生化科技有限公司；PCR反应体系试剂购自宝生物工程有限公司。引物的合成与片段测序由大连宝生物工程有限公司完成。

1.2 实验方法

1.2.1 特异性引物的设计根据李常保等的研究［11］，合成了上游引物TYLCV-F：5'-ACGCATGCCTC TAATCC AGTGTA- 3'和 TYLCV-R：5'-CCAATAAGGCGTAAGCGTGTA GAC-3'。所要扩增的目的条带为543 bp。该引物是针对TYLCV的特异区段设计，只与TYLCV的特异区结合，因此，可以通过PCR技术来判断白银地区番茄植株是否感染TYLCV。

1.2.2 植物基因组DNA提取及PCR扩增取具有番茄黄化曲叶病毒病症状的番茄叶片，按照植物基因组DNA提取试剂盒的说明提取番茄基因组DNA，利用引物TYLCV-F和TYLCV-R进行PCR扩增。扩增体系为25μL，其中10×PCR buffer 2.5μL，dNTP（10mmol/L）1μL，DNA模板3μL，上下游引物（10mmol/L）各1μL，rTaq酶（5 U/μL）0.5μL，ddH2O 16μL。PCR扩增条件为：第一阶段，94℃预变性4min；第二阶段，94℃变性45 s，50℃复性45 s，72℃延伸1min，共35个循环；第三阶段，72℃延伸10min。PCR产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳，最后利用凝胶自动成像仪检测拍照。

2 结果与分析

2.1 番茄黄化曲叶病毒病的田间感病表现

如图1所示，采集的番茄植株样品表现为矮缩、生长变缓甚至停滞，叶片边缘逐渐黄化且变小，符合黄化曲叶病毒病的发病症状。

2.2 番茄黄化曲叶病毒病的PCR 鉴定

以感病番茄叶片的病毒DNA为模板进行PCR扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示。得到543 bp大小的特异性条带，以水为模板的PCR结果无条带。将测序结果（图3）在NCBI网站（www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）上进行BLAST比对，结果表明PCR扩增所得的543 bp序列的特异性条带是番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）的部分序列，根据以上结果，可以诊断确定白银地区的番茄感染了TYLCV。

图1 番茄田间感病表型

M 1 2 3

图2 凝胶电泳检测结果

图3 PCR产物回收测序结果

3 小结与讨论

1）以李常保等研究为依据［11］，以PCR技术为鉴定方法，对白银地区的番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）进行了分子鉴定。结果表明，从具有典型番茄黄化曲叶病毒病病症的植株上所采集的病毒，经过PCR检测及测序比对分析后，证实其确实为TYLCV，同时证明通过PCR技术可以方便快捷、准确高效地检测到番茄所感染TYLCV的情况。

2）番茄黄化曲叶病毒病的危害严重，且依靠烟粉虱来传播，传播广泛，已经成为威胁番茄产量与品质的重要病害。在生长发育早期染病的番茄，其生长、开花和座果将受到严重影响，甚至导致毁灭性的绝产；在生长发育后期染病的番茄，番茄的上部叶片及新生叶结果少且小，严重影响了番茄的产量及品质［12］。

3）番茄黄化曲叶病毒病一旦大面积的发生，会给经济造成不可估量的损失，因此，今后的研究还应着重培育适合不同地区种植的抗番茄黄化曲叶病毒病的番茄品种，并着重追踪该病毒的变异以及进化情况，从而有效的控制病情并为培育新的抗病品种奠定理论依据。

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［2］蔡建和，秦碧霞，朱桂宁，等. 番茄黄花曲叶病毒病在广西爆发的原因和防治策略［J］. 中国蔬菜，2006（7）：47-48.

［3］何自福，虞皓，毛明杰，等. 中国台湾番茄曲叶病毒侵染引起广东番茄黄化曲叶病［J］. 农业生物技术学报，2007，15（1）：119-123.

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［10］严焕兰. 凉州区番茄黄化曲叶病毒病的发生及防治［J］. 甘肃农业科技，2013（8）：59-60.